斜帶石斑魚(yú)生長(zhǎng)抑素前體基因的克隆、表達(dá)和基因重組.pdf

1、魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)主要由生長(zhǎng)激素-胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ軸(GH-ⅠGF-Ⅰaxis)調(diào)節(jié)。GH-ⅠGF-Ⅰ軸的作用開(kāi)始于垂體中GH的產(chǎn)生，而GH的產(chǎn)生受多種下丘腦激素的控制，包括生長(zhǎng)抑素(SS)。生長(zhǎng)抑素已被確認(rèn)為一種廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織的多功能肽，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生理過(guò)程，調(diào)節(jié)著機(jī)體的生長(zhǎng)、發(fā)育和代謝等多種生理過(guò)程。 本研究結(jié)合RT-PCR和5’，3'-race方法從斜帶石斑魚(yú)(Epinepheluscoioides)的下丘腦

2、中分離到3種生長(zhǎng)抑素前體基因cDNA全序列，這是繼金魚(yú)之后第二例在同一種脊椎動(dòng)物中克隆到3種不同類(lèi)型生長(zhǎng)抑素前體基因的報(bào)道。其中斜帶石斑魚(yú)Ⅰ型生長(zhǎng)抑素前體(PSSⅠ)cDNA編碼123個(gè)氨基酸，其C端具有酶切識(shí)別位點(diǎn)可剪切產(chǎn)生與所有報(bào)道過(guò)的物種的Ⅰ型生長(zhǎng)抑素氨基酸序列完全相同的14肽(SS14)；斜帶石斑魚(yú)Ⅱ型生長(zhǎng)抑素前體(PSSⅡ)cDNA共編碼127個(gè)氨基酸，帶有酶切識(shí)別位點(diǎn)可剪切產(chǎn)生28肽的生長(zhǎng)抑素SS28，在其C端帶有SS14變

3、異體，此SS14變異體的氨基酸序列與已報(bào)道的魚(yú)類(lèi)SS14變異體的相同，與哺乳類(lèi)的SS28C端的SS14有2個(gè)殘基的不同(由Tyr7和Gly10分別代替了phe7和Thr10)；斜帶石斑魚(yú)Ⅲ型生長(zhǎng)抑素前體(PSSⅢ)cDNA編碼110個(gè)氨基酸，帶有酶切識(shí)別位點(diǎn)可剪切產(chǎn)生[Pro2]SS14。斜帶石斑魚(yú)PSSⅠ和Ⅱ型基因與美洲鮟鱇(Lophiusamercanus)的PSSⅠ和PSSⅡ的同源性最高。斜帶石斑魚(yú)PSSⅢ基因則與金魚(yú)(Caras

4、siusauratus)PSSⅢ有較高的同源性。采用RT-PCR法結(jié)合Southernblot方法對(duì)斜帶石斑魚(yú)成魚(yú)的腦部、垂體及外周組織、胚胎期和個(gè)體發(fā)育不同階段3種PSS的mRNA進(jìn)行半定量分析，結(jié)果表明3種PSS在垂體及下丘腦等腦部各區(qū)均有不同水平的分布。在外周組織中，PSSⅡ比PSSⅠ和PSSⅢ有更廣泛的組織分布。胃、腸道和卵巢組織PSS的表達(dá)量較高。3種PSS的mRNA在未受精卵、受精卵及胚胎發(fā)育各期均有分布，孵化出膜前表達(dá)量最

5、高，而出膜后迅速下降；仔魚(yú)個(gè)體發(fā)育過(guò)程中3種PSS基因也均有較大量的表達(dá)。mRNA的分布顯示斜帶石斑魚(yú)的3種PSS基因產(chǎn)物在成魚(yú)以及胚胎的組織分化、仔魚(yú)的發(fā)育過(guò)程起著重要的生理作用。 為了進(jìn)一步開(kāi)展對(duì)生長(zhǎng)抑素功能及應(yīng)用的研究，本研究利用本校生命科學(xué)學(xué)院許安龍教授實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的原核表達(dá)載體pTRX，進(jìn)行SS14融合表達(dá)。攜帶pTRX-SS14表達(dá)載體的BL21菌株經(jīng)誘導(dǎo)后獲得分子量大小約為15000Da的TRX-SS14融合蛋白，且

6、有較高的表達(dá)量(21～39.9％)。在22～37℃范圍內(nèi)表達(dá)的融合蛋白均具有較高的可溶性(≥34％)。利用6His-tag經(jīng)金屬Ni2+離子親合層析柱純化獲得高純度融合蛋白(95.6％)。放射免疫檢測(cè)顯示全菌和上清中SS14抗原濃度較高(分別含66.27pg/μl和79.49pg/μl)，并說(shuō)明SS14抗原決定簇呈現(xiàn)在融合蛋白TRX-SS14的表面。采用pTRX和pGEX二種不同的融合表達(dá)載體系統(tǒng)進(jìn)行多拷貝SS14融合表達(dá)載體的構(gòu)建與誘

7、導(dǎo)表達(dá)，其中采用pGEX所構(gòu)建的3拷貝SS14能順利表達(dá)，而pTRX多拷貝的表達(dá)水平低或不表達(dá)。用RNA結(jié)構(gòu)軟件計(jì)算所構(gòu)建的融合基因RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的自由能，顯示在融合基因表達(dá)載體構(gòu)建過(guò)程中，插入的外源基因盡管不改變5’和3’端的主要結(jié)構(gòu)域，仍會(huì)對(duì)RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)及表達(dá)水平產(chǎn)生影響。 利用所制備的重組融合蛋白TRX-SS14作為抗原與弗氏完全佐劑乳化后免疫新西蘭兔，制備了重組生長(zhǎng)抑素抗體。酶聯(lián)免疫(ELISA法)檢測(cè)顯示獲得的抗體效