降脂藥普羅布考改善大鼠非酒精性脂肪性肝炎的機制研究.pdf

1、第一部分建立非酒精性脂肪性肝炎大鼠模型及普羅布考對該模型大鼠血清學指標及肝臟病理的影響
　　目的：1、模擬人體非酒精性脂肪性肝炎的發(fā)病過程，建立可靠的非酒精性脂肪性肝炎的大鼠模型。2、探討降脂藥物普羅布考對非酒精性脂肪性肝炎大鼠血清學相關(guān)指標的影響，及對肝臟病理的改善作用。
　　方法：雄性SD大鼠40只，隨機分4組：(1)正常對照組(10只)，予以普通飼料；(2)高脂組(10只)，予以高脂飼料(飼料成分為：15％豬油，2％膽

2、固醇，83％普通飼料)；(3)普羅布考對照組(10只)，予以普通飼料同時加普羅布考灌胃(500mg/Kg/天，15周)；(4)普羅布考干預組(10只)，予以高脂飼料同時加普羅布考灌胃(500mg/Kg/天，15周)。喂養(yǎng)15周后處死大鼠，抽取心臟血液行血清學指標水平的檢測：(1)一般指標：轉(zhuǎn)氨酶、血脂、血糖、胰島素，同時計算胰島素抵抗指數(shù)(Insulin resistance index，IRI)；(2)ELISA法測定血清脂肪因子脂聯(lián)

3、素(adiponectin)、及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)濃度。同時取肝組織：(1)測定大鼠肝重、體重并計算其比值；(2)部分肝組織固定、包埋、切片、行HE染色，然后進行非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholicfatty liver disease，NAFLD)活動度積分(a NAFLD activity score，NAS)評定，病理評分采用2005年美國國立衛(wèi)生研究院非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic stea

4、tohepatitis，NASH)臨床研究網(wǎng)病理工作組所制定的標準。
　　結(jié)果：與高脂組比較，普羅布考干預組大鼠體重無顯著差異(466.7±30.9g vs439.4±47.3g，p>0.05)，但其肝重(21.1±1.3g vs17.6±3.6g，p<0.05)，及肝臟濕重/體重比值顯著降低(0.045±0.0043vs0.039±0.007，p<0.05)。
　　與高脂組比較，普羅布考干預組血清ALT(126.40±52

5、.56U/L vs80.18±22.90U/L，p<0.01)、AST(250.40±30.45U/L vs179.45±41.14U/L，p<0.01)及膽固醇(2.7±.0.2mmol/L vs2.4±0.3mmol/L，p<0.01)、游離脂肪酸(0.734±.0.11mmol/L vs0.557±0.19mmol/L，p<0.05)顯著降低，甘油三脂水平無顯著差異(0.9±0.3 vs0.8±0.1，p>0.05)。
　　

6、與高脂組比較，普羅布考干預組空腹血糖無顯著降低(7.41±0.56mmol/Lvs6.91±0.21mmol/L，p>0.05)、空腹胰島素水平(15.75±2.14mU/L vs12.02±1.90mU/L，p<0.01)及胰島素抵抗指數(shù)(5.21±1.00 vs3.72±0.70，p<0.01)均顯著降低。
　　與高脂組比較，普羅布考干預組血清脂聯(lián)素水平顯著升高(11.98±2.28μg/ml/Lvs15.31±2.41μg/

7、ml，p<0.05)，而炎癥反應因子腫瘤壞死因子-α僅水平顯著降低(311.0±40.3pg/ml/Lvs162.8±28.9pg/ml，p<0.01)。
　　HE染色病理結(jié)果提示：與高脂組比較，普羅布考干預組脂肪變性顯著減輕(3.00±0.00 vs2.10+0.316，p<0.01)，炎癥浸潤顯著降低(2.30±0.48 vs1.00±0.471，p<0.05)，但兩組氣球樣變無顯著差異(0.30±0.48 vs0.20±0.

8、421，p>0.05)。
　　結(jié)論：通過高脂喂養(yǎng)建立了非酒精性脂肪性肝炎大鼠模型。普羅布考顯著降低了NASH大鼠肝重及肝重/體重比。顯著降低了血清轉(zhuǎn)氨酶ALT、AST、血清膽固醇及游離脂肪酸水平。顯著改善脂肪變性及炎癥浸潤。并有改善胰島素抵抗的作用。
　　第二部分普羅布考對非酒精性脂肪性肝炎大鼠脂肪細胞大小、分泌及合成功能的影響
　　目的：探討普羅布考對NASH大鼠脂肪細胞大小的影響，探討普羅布考對NASH大鼠脂肪細胞

9、脂質(zhì)合成及脂肪因子脂聯(lián)素分泌功能的影響。
　　方法：雄性SD大鼠40只，隨機分4組：(1)正常對照組(10只)，予以普通飼料；(2)高脂組(10只)，予以高脂飼料(飼料組分為：15％豬油，2％膽固醇，83％普通飼料)；(3)普羅布考對照組(10只)，予以普通飼料同時加普羅布考灌胃(500mg/Kg/天，15周)；(4)普羅布考干預組(10只)，予以高脂飼料同時加普羅布考灌胃(500mg/Kg/天，15周)。15周后處死大鼠取脂肪組

10、織組織固定、包埋、切片、行 HE染色，以NIS-Elements BR3.2軟件進行定量分析，計算分析各組脂肪細胞的直徑及面積平均值差異。提取脂肪組織的RNA及蛋白質(zhì)，RT-PCR方法測定脂肪組織中脂聯(lián)素mRAN的表達，Western Blot方法檢測脂肪組織中p-AMPK，ACC1蛋白的表達水平。
　　結(jié)果：高脂喂養(yǎng)組脂肪細胞的直徑及面積較正常對照組顯著增加(p<0.05)，普羅布考干預組脂肪細胞的直徑及面積較高脂喂養(yǎng)組顯著減小

11、(p<0.05)。高脂喂養(yǎng)組的脂肪細胞分泌脂聯(lián)素的水平較正常組顯著降低(p<0.05)，經(jīng)普羅布考干預治療后，脂聯(lián)素的mRNA表達水平有顯著上升(p<0.05)。與高脂組比較，普羅布考干預組p-AMPK水平顯著增高(p<0.05)，而ACC1的蛋白表達水平顯著降低(p<0.05)。
　　結(jié)論：普羅布考可縮小高脂喂養(yǎng)大鼠組脂肪細胞的大小(直徑、面積)，增加脂肪細胞脂聯(lián)素的分泌，通過AMPK途徑降低脂肪細胞脂肪酸的合成。
　　第

12、三部分普羅布考對非酒精性脂肪性肝炎大鼠脂質(zhì)代謝、氧化應激及炎癥應激的改善作用
　　目的：探討普羅布考改善大鼠非酒精性脂肪性肝炎脂質(zhì)代謝的分子機制，探討普羅布考對NASH大鼠肝臟氧化應激及炎癥應激狀態(tài)的影響。
　　方法：雄性SD大鼠40只，隨機分4組：(1)正常對照組(10只)，予以普通飼料；(2)高脂組(10只)，予以高脂飼料(飼料組分為：15％豬油，2％膽固醇，83％普通飼料)；(3)普羅布考對照組(10只)，予以普通飼料

13、同時加普羅布考灌胃(500mg/Kg/天，15周)；(4)普羅布考干預組(10只)，予以高脂飼料同時加普羅布考灌胃(500mg/Kg/天，15周)。15周后處死大鼠取肝組織迅速放入液氮中備檢測。以RT-PCR的方法檢測LXR-α，SREBP-1c、FAS、ACC1的mRNA表達水平，以Western Blot檢測方法檢測肝臟p-AMPK、LXR-α、SREBP-1c、ACC1及HMG-CoA reducase的蛋白表達水平。用免疫組織化

14、學染色法檢測NF-κB蛋白在肝臟表達情況。提取肝臟蛋白做氧化應激相關(guān)指標MDA、SOD、GSH-Px、及CAT的檢測。
　　結(jié)果：與正常組比較，高脂喂養(yǎng)組LXR-α、SREBP-1c、FAS、ACC1mRNA及蛋白表達水平顯著上升(p<0.05)，p-AMPK蛋白表達顯著下降(p<0.05)，HGM-CoA reducase蛋白表達水平顯著上升(p<0.05)。與高脂組比較，經(jīng)普羅布考干預治療后，大鼠肝組織LXR-α、SREBP-

15、1c、FAS、ACC1 mRNA及蛋白表達水平顯著降低(p<0.05)，AMPK顯著增高(p<0.05)，HGM-CoA reducase蛋白表達水平顯著降低(p<0.05)。免疫組化提示與高脂組比較，普羅布考干預治療組NF-κB蛋白的表達水平下調(diào)(p<0.05)。與正常對照組比較，高脂喂養(yǎng)組的MDA水平顯著增高，而抗氧化應激酶SOD、CAT、GSH-Px則顯著降低(p<0.05)，經(jīng)普羅布考干預治療后，MDA的水平較高脂組顯著降低(p