Ad-HGF對大鼠肝纖維化的基因治療.pdf

1、肝纖維化是各種致病因子持續(xù)作用于肝臟所導致各種慢性肝病的共同結果，是一種受損肝細胞的修復性反應。肝星狀細胞的活化被公認為是各種慢性肝病最終向肝纖維化轉變的必要條件。同時，許多細胞因子參與到肝纖維化的過程中，其中以轉化生長因子β1(TGF-β1)最為關鍵。TGF-βl可以促進肝星狀細胞的活化、細胞外基質的沉積并抑制膠原纖維的降解。 肝細胞生長因子(HGF)是一種具有促肝細胞有絲分裂、抑制肝細胞凋亡、抑制肝細胞炎癥等作用的多功能細胞

2、因子?？紤]到肝細胞生長因子的缺乏可能與慢性肝病的發(fā)生息息相關，而肝纖維化又是各種慢性肝病的共同結果，因此認為給予一定量的肝細胞生長因子可能是改善肝纖維化的一種嶄新的治療策略。 目的： 觀察不同時間點CCl4復合因素誘導的大鼠肝纖維化模型的變化，尋求最佳的給藥時間點和實驗結束的時間點。觀察肝細胞生長因子(HGF)對ccl4復合因素誘導的肝纖維化大鼠基因治療的效果，探討Ad-HGF逆轉肝纖維化的作用機制。 方法： 1

3、.觀察CCh復合因素誘導的肝纖維化大鼠的動態(tài)變化 40只雄性Wistar大鼠，隨機分為兩個大組：模型組(25只)、正常對照組(15只)。模型組大鼠采用CCl4復合法(40％CCl4/橄欖油、高脂低蛋白飼料、5％乙醇)制備大鼠肝纖維化模型，正常對照組大鼠皮下注射等量的橄欖油。于造模的1周，4周，8周末，從模型組和正常對照組中分別隨機各選取5只大鼠組成：1周模型組、1周正常組、4周模型組、4周正常組、8周模型組、8周正常組，并于這3個相應的

4、時間點被分別處死。檢測大鼠血清生化指標(GOT、GPT、TP、ALB、TBil)、肝指數以及肝組織中羥脯氨酸含量的變化；通過HE染色觀察肝臟組織病理學變化。確定最佳的給藥時間點和實驗結束的時間點。 2.觀察Ad-HGF對大鼠肝纖維化的治療作用25只雄性Wistar大鼠隨機平均分為5組：模型組，正常對照組，低(1×109pfu)、中(2.5x109 pfu)、高(5×109 piU)劑量治療組。模型組和治療組大鼠均采用cch復合法(40％

5、ccl4/橄欖油、高脂低蛋白飼料、5％乙醇)制備大鼠肝纖維化模型，正常對照組大鼠皮下注射等量的橄欖油。從最佳的給藥時間點開始，低、中、高劑量治療組大鼠分別經尾靜脈注射相應劑量Ad-HGF(3次/周，ivx2 wk)，模型組和正常組大鼠給予等體積生理鹽水。在最佳的實驗結束時間點，處死所有大鼠。檢測血清生化指標(GOT、GPT、TP、ALB、 TBil)以及肝組織中Hpy的含量；通過HE染色觀察肝臟組織病理學變化；通過天狼星染色觀察肝臟組織

6、中膠原的分布，并采用美國Image-Pro Plus專業(yè)圖像分析軟件對天狼星染色的切片膠原面積進行定量分析；運用免疫組化方法檢測大鼠肝組織中HGF和TGF-βl的表達，其陽性區(qū)域采用美國Imago-Pro Plus專業(yè)圖像分析軟件進行定量分析。 結果： 1.模型大鼠肝纖維化的階段性變化 與1周正常組比較，1周模型組大鼠血清生化指標GOT、GPT、TBil(均P<0.01)和肝指數(P<0.05)顯著地升高；與4周

7、正常組比較，4周模型組大鼠血清中GOT、GPT、TBil，肝指數以及肝組織中Hyp含量均有顯著(均P<0.01)的升高，TPALB有顯著(均P<0.05)的下降。與8周正常組比較，8周模型大鼠血清中TP、ALB顯著(均P<0.01)下降，GOT、GPT、TBil(均P<0.05)以及肝組織中Hyp含量(P<0.01)均顯著增高。病理組織學檢測結果表明：造模1周時，未見纖維組織形成；造模4周時，見大量纖維組織形成；造模8周時，見假小葉形成

8、。確定最佳的給藥時間點為造模4周末；最佳的實驗終止的時間點為造模8周末。 2.Ad-HGF基因治療大鼠抗肝纖維化的作用 與模型組比較，高劑量組大鼠血清中的GOT、GPT、TP、ALB、TBil都有明顯的改善(P<0.05)，中劑量組和高劑量組肝組織中的膠原面積(P<0.05)、Hyp的含量(P<0.05)、肝細胞損傷程度和肝纖維化程度(P<0.01)都有顯著的下降。免疫組織化學結果顯示：與模型組比較，Ad-HGF在低、中

9、、高劑量組均可以顯著地提高肝組織中HGF蛋白的表達(P<0.05)，顯著地降低肝組織中TGF-β1的表達(P<0.05)。 結論： 1.ccl4復合因素誘導的模型大鼠出現階段性肝纖維化改變。造模4周末是比較理想的給藥時間點，造模8周末是比較理想的造模結束的時間點。2. Ad-HGF基因治療對ccl4誘導的大鼠肝纖維化具有阻斷作用；其作用機制：1)促進HGF基因在肝組織中的表達，從而發(fā)揮其促肝細胞再生、抑制肝細胞凋亡、減輕