豬IFN-γ及其受體的生物學功能研究.pdf

1、IFN-γ是由機體內活化的T淋巴細胞和NK細胞產生的一種糖蛋白，絲裂原以及抗原特異性刺激的T細胞克隆也可產生和分泌。IFN-γ除具有抗病毒、抗胞內寄生菌、抗胞內寄生原蟲、抗細胞增殖的作用外，還具有獨特而強大的免疫調節(jié)功能，可促進MHCⅡ類抗原的表達，增強APC與T細胞的相互作用，增強Th細胞和CTL轉化的能力等。IFN-γ有較為嚴格的種屬特異性，不同物種之間通用使其活性降低或失去作用。 IFN-γ活性形式為兩條單體鏈結合形成的同

2、型二聚體形式，單體沒有生物學活性。IFN-γ作為機體免疫應答的產物，一方面是機體發(fā)揮免疫功能，清除胞內寄生病原體不可缺少的成分，與疾病的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關系；另一方面，機體內IFN-γ分泌過量，可引起病理性反應。由于IFN-γ具有上述諸多重要的生物學活性，故其在疾病的診斷、治療和預防等方面具有廣闊的應用前景。但是，IFN-γ在臨床應用時可引起發(fā)熱、寒戰(zhàn)、惡心等一系列的副作用，而且有些不良反應是不可逆的損害，這限制了其在臨床中的應用。

3、因此，開展新型、低毒副作用的pIFN-γ研究意義重大。 此外。IFN-γ必須與受體相結合，通過受體的介導才能發(fā)揮其生物學效應，對其受體的研究將有利于明確IFN-γ的作用機制，進而發(fā)現(xiàn)疾病治療和預防的新途徑。 本論文在對克隆的pIFN-γ基因進行適當?shù)母脑?，去除其信號肽序列，將該基因與pGEX-4T-1載體上的谷胱甘肽S-轉移酶(GST)拼接，然后在原核表達系統(tǒng)中進行表達，并對其誘導表達條件、蛋白純化方法進行系統(tǒng)研究，最終

4、獲得了純度高達95％的GST-pIFN-γ融合蛋白，產量為0.4～0.5g/L培養(yǎng)液。體外試驗證實該重組蛋白具有較高的生物活性，可有效抑制PRV(DNA病毒)和FMDV(RNA病毒)的復制，并且具有穩(wěn)定、不宜降解和低毒副作用的優(yōu)點。開展了重組pIFN-γ體外抗弓形蟲研究，結果表明pIFN-γ可誘導豬腹腔巨噬細胞產生抗蟲作用，且隨pIFN-γ量的增加抗弓形蟲作用越明顯，但任何濃度的重組pIFN-γ對弓形蟲入侵PK15細胞無明顯影響。

5、 對pIFN-γ誘導永生化細胞(PK15細胞)凋亡的作用及其對細胞端粒酶的影響進行了研究，結果發(fā)現(xiàn)在高濃度pIFN-γ的長時間誘導下，PK15細胞端粒酶顯著下降，因此PK15細胞(腫瘤樣細胞)發(fā)生凋亡，具體表現(xiàn)為細胞變圓脫落，DNA出現(xiàn)典型的“梯狀帶”，熒光染色可發(fā)現(xiàn)細胞核固縮，有凋亡小體出現(xiàn)； 但如果用低濃度pIFN-γ進行誘導作用，PK15細胞端粒酶明顯升高；該研究結果為IFN-γ臨床治療腫瘤提供了理論依據和指導。

6、 以表達純化的GST-pIFN-γ作為抗原免疫BALB/C小鼠，取其脾細胞和SP2/0細胞融合，再經純化的GST-pIFN-γ和的帶組氨酸標簽pIFN-γ作為包被抗原進行篩選，最終獲得2株分泌pIFN-γ單抗的雜交瘤細胞株，經鑒定這兩株單抗抗體亞類均屬于IgG2a，輕鏈為k型，對雜交瘤細胞株的染色體組型、單抗的穩(wěn)定性及其識別的抗原位點等進行分析，結果證明所獲2株單抗均表現(xiàn)穩(wěn)定，可滿足常規(guī)實驗的要求。在對不同動物IFNGR兩條鏈基因序列比

7、對基礎上，選擇保守區(qū)段作為引物； 然后分離豬外周血淋巴細胞，經刺激后提取細胞總RNA，應用RT-PCR方法克隆了豬IFNGR兩條鏈基因，序列測定表明豬IFNGR1基因ORF為1413bp，共編碼470個氨基酸；豬IFNGR2基因ORF為1110bp，共編碼369個氨基酸。對不同物種IFNGR序列比較發(fā)現(xiàn)，不同物種間的差異比較大，據此推測這可能是IFN-γ種屬特異性的重要原因之一。 然后利用分子生物學軟件對兩條鏈進行結構預

8、測，設計引物擴增豬IFNGR胞外區(qū)片段并對其進行原核表達，經鑒定該基因在原核中得到正確表達；開展了兩條受體鏈胞外區(qū)對pIFN-γ抗病毒活性的影響研究，發(fā)現(xiàn)豬IFNGR1胞外區(qū)可降低pIFN-γ抗病毒活性，而IFNGR2胞外區(qū)可增強pIFN-γ抗病毒活性，由此可知豬IFNGR兩條鏈均可結合pIFN-γ； 此外，推測豬IFNGR1具有信號轉導功能且是IFN－γ信號轉導的主要執(zhí)行者，而IFNGR2則在IFN－γ信號轉導中起次要作用或沒