VEGF跨血腦屏障“時間窗”在新生大鼠缺氧缺血性腦損傷模型中的研究.pdf

1、目的：本研究通過建立新生大鼠缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）模型，觀察新生大鼠HIBD模型血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)穿透血腦屏障(Blood brain barrier，BBB)的時間，探討HIBD時BBB通透性改變的“時間窗”，為VEGF在HIBD中應用提供最佳給藥方法和治療時間的實驗依據。
　　方法：

2、將VEGF經二種途徑(骨髓腔、鼻腔)在不同時間點同時給予7日齡SD新生大鼠HIBD模型，同時設假手術組、HIBD組、HIBD骨髓腔注射VEGF組及HIBD鼻腔滴VEGF組，每組各48只。四組根據處死時間不同又分為6個亞組：2h組、6h組、12h組、24h組、48h組、72h組，每亞組各8只。HIBD模型采用阻斷左側頸總動脈后置于含8％O292%N2混合氣體的低氧環(huán)境中2h制備而成。HIBD骨髓腔注射VEGF組及HIBD鼻腔滴VEGF組均

3、于處死前半小時給VEGF。在設定時間點觀察各組大鼠運動行為學變化、腦組織外觀、腦組織病理改變及ELISA法檢測腦組織勻漿中VEGF水平。
　　結果：（1）7日齡SD大鼠在HIBD后出現不同程度的行為異常。（2）假手術組腦組織在各時間點外觀正常，兩側對稱，無水腫、軟化及液化壞死灶。HIBD模型組在12h左側腦組織出現輕微水腫、體積增大；在24h左側腦組織水腫明顯，局部可呈蒼白色；在48h、72h左側腦組織水腫程度加重，局部可見軟化、

4、液化壞死灶。（3）HE染色：假手術組腦組織在各時間點結構層次清楚、細胞形態(tài)正常。HIBD組在12h左側腦組織可有細胞水腫；在24h、48h可見細胞不同程度的水腫、變性壞死、溶解、核固縮及核碎裂；72h細胞壞死更明顯。（4）這四組新生大鼠在2h、6h、12h、24h、48h、72h ELISA法檢測10%腦組織勻漿VEGF水平分別為，假手術組：119.7±12.6ng/L、117.6±12.4ng/L、120.9±12.1ng/L、124

5、.1±12.2ng/L、121.3±12.2ng/L、119.3±10.9ng/L，HIBD組：118.9±11.3ng/L、129.7±12.5ng/L、164.1±14.6ng/L、208.5±15.8ng/L、177.6±13.6ng/L、159.3±16.1ng/L，骨髓注射組：121.0±10.2ng/L、132.0±9.9ng/L、213.1±23.4ng/L、523.2±26.6ng/L、463.3±39.4ng/L、37

6、1.1±16.7ng/L，鼻腔組：224.5±19.1ng/L、231.9±20.0ng/L、237.6±21.4ng/L、231.3±19.3ng/L、218.6±29.6ng/L、227.9±22.1ng/L。這可觀察到：假手術組在各時間點腦組織勻漿中VEGF水平沒有明顯變化，差異無統計學意義（P>0.05），提示假手術組在各時間點腦組織勻漿中 VEGF水平是相對穩(wěn)定的。HIBD組在各時間點腦組織勻漿中VEGF水平有明顯不同，差異有

7、統計學意義（P<0.01）；2h與6h之間VEGF水平無明顯變化，差異無統計學意義（P>0.05）；隨著HIBD后時間的延長，在12h、24h、48h、72h VEGF水平均較2h、6h升高，差異均有統計學意義（Pa<0.01），尤其在24h腦組織勻漿中VEGF水平較12h、48h、72h均明顯升高，差異均有統計學意義（Pa<0.01），72h較48h明顯下降，差異有統計學意義（P<0.05），表明HIBD組腦組織勻漿中VEGF水平在2

8、h至6h沒有升高，在6h后至12h開始升高，于24h達高峰，至48h開始下降，于72h明顯下降。本實驗對HIBD組腦組織免疫組織化學染色在12h染色開始明顯，24h染色達到高峰，至48h染色開始下降，于72h染色明顯下降，這與ELISA法檢測腦組織勻漿中VEGF水平變化相一致。骨髓注射組在不同時間點間腦組織勻漿中 VEGF水平有明顯不同，差異有統計學意義（P<0.01），而2h與6h之間VEGF水平無明顯變化，差異無統計學意義（P>0.

9、05），但在12h、24h、48h、72h VEGF水平均較2h、6h升高，差異均有統計學意義（Pa<0.01），尤其在24h腦組織勻漿中VEGF水平均較12h、48h、72h明顯升高，差異均有統計學意義（Pa<0.01），72h較48h明顯下降，差異有統計學意義（P<0.05），表明骨髓注射組腦組織勻漿中VEGF水平在12h開始升高，于24h達高峰，至48h開始下降，于72h明顯下降，且在此時間段VEGF水平明顯高于HIBD組，這提示

10、HIBD12h后VEGF可以跨過BBB，即HIBD后12h BBB通透性明顯增加，在24h通透性最高，于48h通透性開始降低，至72h通透性明顯降低。鼻腔組在不同時間點間腦組織勻漿中VEGF水平沒有明顯變化，差異無統計學意義（P>0.05），表明鼻腔組在不同時間點間腦組織勻漿中VEGF水平是相對穩(wěn)定的。
　　在相同時間點不同組別間的比較：在2h、6h時間點均可觀察到假手術組、HIBD組、骨髓注射組各組間腦組織勻漿中VEGF水平均沒

11、有明顯變化，差異均無統計學意義（Pa>0.05）；鼻腔組較假手術組、HIBD組、骨髓注射組腦組織勻漿中VEGF水平均明顯升高，差異均有統計學意義（Pa<0.01）。這提示在HIBD后2h、6h骨髓途徑給予VEGF均不能進入腦組織，且腦組織缺氧缺血2h、6h沒有影響腦組織VEGF水平，但鼻腔途徑給予VEGF均可以相對穩(wěn)定的水平進入腦組織。在12h、24h、48h、72h時間點均可觀察到HIBD組、骨髓注射組、鼻腔組腦組織勻漿中VEGF水平

12、均較假手術組明顯升高，差異均有統計學意義（Pa<0.01）；骨髓注射組、鼻腔組腦組織勻漿中VEGF水平均較HIBD組明顯升高，差異均有統計學意義（Pa<0.01）。在24h、48h、72h時間點均可觀察到骨髓注射組腦組織勻漿中VEGF水平均較鼻腔組明顯升高，差異均有統計學意義（Pa<0.01）。這些提示腦組織缺氧缺血12h、24h、48h、72h可以使腦組織VEGF表達水平升高；在HIBD后12h、24h、48h、72h骨髓途徑給予VE

13、GF均可不同程度地進入腦組織，尤其在HIBD后24h、48h為最明顯，但于72h開始呈下降趨勢，即說明HIBD后12h BBB通透性明顯增加，在24h通透性最高，于48h通透性開始下降，至72h通透性明顯降低。鼻腔組在不同時間點間腦組織勻漿中 VEGF水平是相對穩(wěn)定的，且在各時間點VEGF水平都明顯高于HIBD組，這說明在HIBD后各時間點經鼻腔途徑給予VEGF均可以相對穩(wěn)定的水平進入腦組織，并說明本組腦組織中VEGF水平與HIBD無關

14、，即與BBB通透性改變無關，提示鼻腔途徑給VEGF不是經過BBB進入腦組織，而可能是經其它途徑，如嗅覺通路和三叉神經通路進入腦組織。
　　結論：7日齡SD大鼠HIBD后，其腦組織VEGF表達在12h開始升高，隨著時間的延長，于24h達高峰，至48h開始下降，于72h明顯下降；在HIBD后2h、6h、12h、24h、48h、72h鼻腔途徑給予VEGF均可以相對穩(wěn)定的水平進入腦組織，即提示鼻腔途徑給VEGF不是經過BBB進入腦組織，而