抗維生素D佝僂病PHEX基因診斷研究.pdf

1、抗維生素D佝僂病(vitamin D resistant rickets)是一種以低磷酸鹽血癥導(dǎo)致骨發(fā)育障礙為特征的遺傳性骨病。遺傳方式多屬X連鎖顯性遺傳，偶為常染色體顯性或隱性遺傳，亦有部分病例呈散發(fā)，并無家族史。它與一般佝僂病不同，其發(fā)病原因是由于腎小管對(duì)磷的再吸收障礙，從而血磷下降，尿磷增多，腸道對(duì)磷，鈣的吸收不良而影響骨質(zhì)鈣化，形成佝僂病。治療這種佝僂病時(shí)，采用普通劑量的維生素D和曬太陽(yáng)均難以收效，必須聯(lián)合使用大劑量維生素D和磷

2、酸鹽才能起治療效果，所以通常稱為抗維生素D佝僂病。抗維生素D佝僂病發(fā)病率約為1:20,000。本病多發(fā)生于兒童，主要表現(xiàn)為生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，身材矮小，雙下肢彎曲畸形，下肢疼痛，行走無力，骨質(zhì)疏松或多發(fā)性骨折，牙釉質(zhì)發(fā)育不良。在成人主要表現(xiàn)為軟骨病和骨關(guān)節(jié)畸形?；颊咧橇φ?。盡管可以通過手術(shù)的方式予以改善癥狀，但手術(shù)治療會(huì)給患兒家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，療效也因人而異，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。所以，只有明確其基因突變特點(diǎn)，才能從遺傳篩查和基因診

3、斷及治療入手，避免患兒出生，糾正遺傳缺陷，最終從根本上解決問題。 抗維生素D佝僂病的基因按其功能命名，稱為PHEX基因(磷酸鹽調(diào)節(jié)基因)。PHEX cDNA全長(zhǎng)已經(jīng)被克隆，包含2247bp跨22個(gè)外顯子的編碼區(qū)，編碼一條749個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。PHEX和中性肽鏈內(nèi)切酶基因家族有高度的同源性，其家族包括中性肽鏈內(nèi)切酶，Kell抗原，及內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶1(ECE-1)等。PHEX基因突變是導(dǎo)致此疾病的主要原因。國(guó)外學(xué)者多用SSCP方法對(duì)

4、PHEX基因突變進(jìn)行了大量的研究，發(fā)現(xiàn)了一系列PHEX基因的突變，國(guó)內(nèi)對(duì)此病的基因診斷研究還未見報(bào)導(dǎo)。本研究應(yīng)用DGGE方法對(duì)家族性及非家族性(散發(fā))抗維生素D佝僂病患者進(jìn)行PHEX基因突變分析。并且對(duì)PHEX基因內(nèi)5個(gè)未報(bào)導(dǎo)過的STR位點(diǎn)進(jìn)行了多態(tài)性分析，探索簡(jiǎn)易、快速并易于推廣的抗維生素D佝僂病基因診斷方法。 材料與方法 一、研究對(duì)象 10例抗維生素D佝僂病患者的靜脈抗凝血，標(biāo)本由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)院兒科

5、提供。所有患者均具有典型的臨床表現(xiàn)。100例正常女性DNA，研究對(duì)象均來自中國(guó)東北地區(qū)正常漢族人群。 二、實(shí)驗(yàn)方法 1、應(yīng)用常規(guī)飽和酚一氯仿法提取基因組DNA。 2、PCR-DGGE方法檢測(cè)PHEX基因突變(1)PCR擴(kuò)增(2)DGGE檢測(cè)(3)確定突變位點(diǎn)：和正常電泳帶相比發(fā)生泳動(dòng)變位的擴(kuò)增產(chǎn)物重復(fù)兩次后進(jìn)行DNA測(cè)序以確定序列改變的位置與性質(zhì)，并對(duì)100例正常人DNA的相同位點(diǎn)進(jìn)行篩查，以排除該堿基置換是多態(tài)

6、的可能性。 3、STR位點(diǎn)多態(tài)性分析(1)PCR擴(kuò)增(2)銀染法(3)等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物的制備(4)數(shù)據(jù)分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 一、PCR-DGGE檢測(cè)結(jié)果經(jīng)DGGE篩查并測(cè)序發(fā)現(xiàn)一名患者(H11)16外顯子上游46bp(即15內(nèi)含子)處存在T→C的單堿基置換，經(jīng)過對(duì)100名正常人的同一位點(diǎn)進(jìn)行篩查，沒有發(fā)現(xiàn)相同的改變，可以排除多態(tài)，經(jīng)P-match軟件預(yù)測(cè)可能產(chǎn)生新的En-1(轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)肢體發(fā)育)結(jié)合位點(diǎn)，但具體作

7、用是未知的，需要進(jìn)一步的研究。另一家系先證者(H1)及其母親(H2)在18外顯子存在C→T的單堿基置換(CAG-TAG)，翻譯產(chǎn)生的蛋白質(zhì)621位的谷氨酰胺突變?yōu)榻K止密碼子，產(chǎn)生截短的蛋白質(zhì)，先證者為突變型半合子，其母親為雜合型突變，確證了X-連鎖顯性遺傳。 二、STR多態(tài)性分析研究發(fā)現(xiàn)用磁因12內(nèi)含子內(nèi)的AAC重復(fù)序列，TTG重復(fù)序列，15內(nèi)含子的TG重復(fù)序列及基因3’端的GT重復(fù)序列雜合度很低，不能作為基因診斷的DNA遺傳標(biāo)

8、記。16內(nèi)含子內(nèi)的TTTA重復(fù)序列檢測(cè)到5個(gè)等位片段，等位基因頻率范圍為0.03-0.39，基因型為11種，雜合度為69.3％，多態(tài)信息含量0.69，可以作為連鎖分析的遺傳標(biāo)記。 結(jié)論 1、應(yīng)用PCR-DGGE方法對(duì)麟基因的22個(gè)外顯子進(jìn)行突變研究，首次檢測(cè)出刪基因兩種新的突變類型。 2、對(duì)腳基因內(nèi)的5個(gè)S訊位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)16內(nèi)含子的TTTA重復(fù)序列的雜合度和多態(tài)信息含量比較高，可以作為連鎖分析的遺傳標(biāo)