人臍帶間充質(zhì)干細胞來源的誘導(dǎo)性多能干細胞向男性生殖細胞方向誘導(dǎo)分化的研究.pdf

1、【背景與目的】男性不育的發(fā)病率越來越高，據(jù)統(tǒng)計已達到所有育齡夫婦的15％，其中40%-60%是由于男性精子發(fā)生異?；蛘系K，目前人工授精的方式不能滿足所有患者的需要，如何才能讓患者獲得遺傳學(xué)上屬于自己的后代成為目前研究的熱點。人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells,HuMSCs)來源于胚外中胚層，是一種能夠向多個方向分化的成

2、體干細胞,且具有取材方便、低免疫原性等優(yōu)點，我們的前期研究表明，人臍帶間充質(zhì)干細胞（HuMSCs）在新生小鼠睪丸細胞培養(yǎng)液、維甲酸及睪酮的誘導(dǎo)培養(yǎng)下，誘導(dǎo)第7天形態(tài)上開始變細變長，形成類似“蝌蚪樣”細胞，第3、7天表達生殖細胞標(biāo)記OCT4、Ckit、CD49f、Stella，第14天表達生殖細胞特異標(biāo)記DDX4；將 HuMSCs移植至不育小鼠睪丸曲細精管內(nèi)，1個月后能夠表達生殖細胞標(biāo)記Stella、Dazl，移植后不發(fā)生排斥反應(yīng)，且可發(fā)

3、生遷移并能存活至少120天。但是誘導(dǎo)得到的細胞無法進一步誘導(dǎo)分化成為有功能的成熟的男性生殖細胞。目前國內(nèi)外科學(xué)家也未能將成體干細胞成功誘導(dǎo)分化為有功能的生殖細胞，推測可能與成體干細胞分化潛能不足有關(guān)。2006年，日本京都大學(xué)Yamanaka研究小組首次將攜帶Oct4、Sox2、Klf4、c-myc的逆轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入小鼠胚胎成纖維細胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF)，獲得了在形態(tài)學(xué)、基因表達、表面抗原以及分

4、化潛能等方面和胚胎干細胞十分相似的多能干細胞誘導(dǎo)性多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)。此后，多個實驗室分別重編程出人和其他物種的誘導(dǎo)性多能干細胞，且通過使用小分子物質(zhì)、蛋白質(zhì)以及microRNA或者通過基因敲剪等方法提高了重編程效率，2008年，Liao等人利用OCT4、SOX2、KLF4、c-Myc、LIN28、NANOG六因子，成功將人皮膚成纖維細胞重編程為iPS細胞，且重編程效率

5、達到1.6%左右，2010年，Cai等人利用逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶的OCT4、SOX2、KLF4、c-Myc四因子將HuMSCs成功重編程為iPS細胞，但是效率較低下，僅0.4%細胞被重編程。IPS細胞的出現(xiàn)，不僅擺脫了胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)面臨的倫理與免疫排斥問題，而且具有向三胚層分化的潛能，理論上可以向生殖細胞方向分化。目前，生殖細胞的誘導(dǎo)仍是一個世界性難題,僅小鼠ES細胞能夠誘導(dǎo)出可育配子，人類E

6、S細胞及iPS細胞體外經(jīng)藥物誘導(dǎo)誘導(dǎo)或DAZL基因家族過表達能夠較低效率地產(chǎn)生早期原始生殖細胞和減數(shù)分裂后的單倍體細胞，利用小鼠精原干細胞條件培養(yǎng)基加上各種誘導(dǎo)劑也能夠讓 ES細胞突破減數(shù)分裂，但是這些方法均無法形成有功能的人類生殖細胞，誘導(dǎo)效率都非常低下，而且ES細胞面臨取材和倫理及免疫排斥等諸多問題，影響了其臨床應(yīng)用。除人臍帶間充質(zhì)干細胞外，骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM

7、SCs)也能在體外誘導(dǎo)也獲得了早期生殖細胞，但是不能突破減數(shù)分裂，誘導(dǎo)獲得的生殖細胞僅能檢測了生殖細胞早期基因，如：DDX4、DPPA3、CD49f、DAZL等，不能檢測到生殖細胞減數(shù)分裂期以及減數(shù)分裂后期的基因表達,如SYCP3、PRM1等。而iPS細胞能夠經(jīng)過誘導(dǎo)往男性生殖細胞方向分化，表達晚期生殖細胞標(biāo)記，如SYCP3、PRM1等，并且能夠突破減數(shù)分裂形成單倍體細胞。說明iPS細胞具有和ES細胞相似的分化潛能，而且避免了ES細胞面

8、臨的法律與倫理問題。因此，iPS細胞是目前最理想的自體細胞治療的種子細胞，本實驗結(jié)合 HuMSCs及iPS細胞的優(yōu)點，利用慢病毒載體將OCT4、SOX2、KLF4、c-Myc、NANOG和LIN28六個轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入 HuMSCs，將 HuMSCs重編程為 iPS細胞，再用 Bone morphogenetic protein4(BMP4)將iPS細胞向男性生殖細胞方向誘導(dǎo)分化。
　　【材料與方法】采用貼壁法分離、培養(yǎng)、擴增出人臍帶

9、間充質(zhì)干細胞；利用攜帶OCT4、SOX2、KLF4、c-Myc、LIN28和NANOG六因子質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細胞，用293FT細胞包裝攜帶上述六因子的慢病毒；再用慢病毒感染HuMSCs，將HuMSCs重編程為iPS細胞,挑取形態(tài)良好的克隆進行傳代建系,并通過形態(tài)學(xué)觀察、核型分析、堿性磷酸酶染色、多能基因 RT-PCR、ES特異性蛋白免疫熒光、體外擬胚體（embryoid body，EB）形成和體內(nèi)畸胎瘤形成實驗對iPS細胞的鑒定。鑒

10、定完成后，挑選完全重編程的iPS細胞，在體外經(jīng)EB（embryoid body）形成的方法，將其中一株iPS細胞（HuMSC- iPS1）向男性生殖細胞方向誘導(dǎo)分化。EB形成后第一天（D0），向?qū)嶒灲MEB培養(yǎng)基中加入BMP4（100ng/ml），對照組（自發(fā)分化組）繼續(xù)用 EB培養(yǎng)基培養(yǎng)，使其自發(fā)分化。分別于不同時間點（D0、D3、D7和D10）顯微鏡觀察BMP4誘導(dǎo)組和自發(fā)分化組EB的形態(tài)學(xué)差異；RT-qPCR檢測生殖細胞相關(guān)標(biāo)記（D

11、DX4、SYCP3和PRM1）表達量變化(以誘導(dǎo)前即D0的表達量為基礎(chǔ)表達量，不同時間點的表達量均與基礎(chǔ)表達量相比)；細胞免疫熒光檢測生殖細胞早期標(biāo)記 DDX4和減數(shù)分裂相關(guān)標(biāo)記SYCP3。
　　【結(jié)果】OCT4、SOX2、KLF4、c-Myc、LIN28和NANOG六因子感染后第十天就有形態(tài)各異的細胞團出現(xiàn)，感染后第十四天挑取細胞團傳代建系。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、多能基因RT-PCR、細胞核型分析、堿性磷酸酶染色、ES特異性蛋白免疫熒光

12、、體內(nèi)畸胎瘤形成和體外擬胚體形成等實驗鑒定我們獲得的iPS細胞具有與ES細胞類似的特性；重編程效率約為1.25%。獲得的iPS細胞能夠在 BMP4（100ng/ml）誘導(dǎo)下向男性生殖細胞方向分化，生殖細胞標(biāo)記DDX4和SYCP3在誘導(dǎo)第七天表達量最高，分別達到基礎(chǔ)表達量的4倍和5倍以上，而生殖細胞晚期標(biāo)記PRM1的表達量在誘導(dǎo)第十天（D10）達到最高，達到基礎(chǔ)表達量的3倍以上。免疫熒光檢測結(jié)果表明：在誘導(dǎo)第七天（D7），BMP4誘導(dǎo)組和