人脂肪干細(xì)胞協(xié)同顆粒脂肪移植的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:在體外特定的條件下，將人脂肪干細(xì)胞(ADSCs)擴(kuò)增后混合人的顆粒脂肪，將其移植于裸鼠的背部筋膜下，研究并探討脂肪干細(xì)胞在脂肪移植中向脂肪細(xì)胞的分化以及促進(jìn)血管再生的能力，同時(shí)探討移植物中干細(xì)胞與顆粒脂肪的最佳比例，為人脂肪干細(xì)胞在脂肪移植中的臨床應(yīng)用提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.脂肪干細(xì)胞的提取:無菌條件下提取人脂肪組織15g，磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)沖洗干凈以去除殘留血液，眼科剪和眼科鑷剔除脂肪組織中

2、可見結(jié)締組織和血管，剪碎至大小為3mm的細(xì)小顆粒，將其置于Ⅰ型膠原蛋白酶濃度為0.075％的PBS中，在37℃條件下震蕩消化30min，將消化液移入離心管，在800g離心力下離心10分鐘，100目篩網(wǎng)過濾離心管中沉淀物，所得細(xì)胞提取物用DMEM培養(yǎng)液（含10％的胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素、5mg/ml肝素和2ng/ml酸性成纖維細(xì)胞生長因子）[1]重懸，以適當(dāng)密度接種于無菌培養(yǎng)瓶中，在37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5

3、％、飽和濕度的孵箱內(nèi)培養(yǎng)，48h后半量換液，以后每隔3d進(jìn)行換液操作，當(dāng)原代細(xì)胞基本長滿培養(yǎng)瓶底部時(shí)，用0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液將貼壁的細(xì)胞消化，按照1∶3的比例進(jìn)行傳代，接種于無菌培養(yǎng)瓶中，以后傳代均進(jìn)行以上重復(fù)操作。同時(shí)使用流式細(xì)胞術(shù)對即將進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞進(jìn)行表面抗原表達(dá)情況的分析。
　　2.Brdu標(biāo)記脂肪干細(xì)胞:脂肪干細(xì)胞傳至第4代，加入終濃度為10μg/mL的Brdu，48h后檢測標(biāo)記率。其余標(biāo)記細(xì)胞經(jīng)胰蛋白

4、酶消化后混合顆粒脂肪，進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)。
　　3.顆粒脂肪分離:從臨床手術(shù)中提取人類廢棄的脂肪組織，使用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)液沖洗，將殘留的血液去除干凈后，將顆粒脂肪剪碎至0.5～1mm3，置于50mL離心管中，加入適量的干細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM/F12)，在1200r/分的轉(zhuǎn)速下離心3分鐘，得到最終的顆粒脂肪。
　　4.對移植顆粒脂肪進(jìn)行稱重:將顆粒脂肪剪碎離心后，放置于離心管中，對離心管中顆粒脂肪進(jìn)行稱重，將實(shí)驗(yàn)組分為A組

5、、B組、C組、D組共4組，分別加入第4代Brdu標(biāo)記的脂肪干細(xì)胞，干細(xì)胞與顆粒脂肪比例依次為105∶500mg、3×105∶500mg、6×105∶500mg、9×105∶500mg，對照組為單純顆粒脂肪。1mL注射器稱重后抽取500mg顆粒脂肪。
　　5.顆粒脂肪移植:將含有ADSCs的500mg顆粒脂肪注射在裸鼠左側(cè)背部筋膜下，500mg單純的顆粒脂肪注射在裸鼠右側(cè)背部筋膜下。
　　6.移植顆粒脂肪的檢測:于移植后28天

6、時(shí)將裸鼠處死，取出背部移植顆粒脂肪，剝離掉移植物周圍包膜，放置于電子天平上稱重，并記錄。之后置于4％多聚甲醛中固定，對移植物進(jìn)行石蠟切片，分別進(jìn)行蘇木精-伊紅染色、內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD34的檢測以及BRDU抗體標(biāo)記物的檢測。
　　結(jié)果:
　　1.脂肪干細(xì)胞(ADSCs)分離、培養(yǎng)及鑒定:細(xì)胞提取物經(jīng)DMEM培養(yǎng)液重懸后，以適當(dāng)密度接種于無菌培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)3-5天后可觀察到多角形細(xì)胞及梭形細(xì)胞，之后多角形細(xì)胞逐漸變形為梭形細(xì)胞。

7、
　　2.流式細(xì)胞術(shù)檢測:結(jié)果顯示ADSCs陽性表達(dá)CD29、CD44、CD90，而CD31、CD45、CD146幾乎不表達(dá)，證明分離培養(yǎng)獲得的細(xì)胞為較純化的間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　3.ADSCs對移植顆粒脂肪重量的影響:移植4周后實(shí)驗(yàn)組A-D組移植物平均重量分別為(354.22±8.44)mg、(413.79±7.30)mg、(465.53±5.18)mg，(470.42±3.87)mg，重量維持率分別為70.84％、82.7

8、6％、93.12％、94.08％。對照組平均重量為(272.37±9.73)mg，重量維持率為54.47％。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，除C、D兩組重量之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外，其他任意兩組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4.檢測移植脂肪的微血管數(shù)量:在實(shí)驗(yàn)組及對照組的中央?yún)^(qū)和周邊區(qū)取各5個(gè)視野，之后對每個(gè)視野中的微血管數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。利用血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性表面抗原CD34，對切片做免疫組織化學(xué)處理，計(jì)算出每組每平方毫米面積中的微血管的數(shù)量，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形

9、式來表示。中央?yún)^(qū)的血管數(shù)量在A-D組實(shí)驗(yàn)組分別為53.43±8.64個(gè)，65.74±7.07個(gè)，76.79±5.36個(gè)，80.34±4.83個(gè)，對照組為38.04±9.10個(gè)。周圍區(qū)的血管數(shù)量在A-D組實(shí)驗(yàn)組分別為65.20±8.14個(gè)，77.55±7.37個(gè)，88.30±6.33個(gè)，91.89±5.61個(gè)，對照組為47.42±9.96個(gè)。利用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。無論是中央?yún)^(qū)還是周邊區(qū)，實(shí)驗(yàn)組與對照組之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差

10、異(P＜0.05)，說明實(shí)驗(yàn)組的中央?yún)^(qū)和周邊區(qū)的血管數(shù)量大于相應(yīng)的對照組的血管數(shù)量;4組實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行比較，無論是中央?yún)^(qū)還是周邊區(qū)，除了C組與D組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外，其他兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，說明移植干細(xì)胞與顆粒脂肪之間存在一個(gè)最佳比例，即在此基礎(chǔ)上再增加干細(xì)胞的數(shù)量也不會增強(qiáng)移植脂肪的血供;各個(gè)實(shí)驗(yàn)組及對照組進(jìn)行組內(nèi)比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，說明同一組中，中央?yún)^(qū)血管數(shù)量少于周邊區(qū)的血管數(shù)量5免疫組織化學(xué)染色在4組

11、實(shí)驗(yàn)組中均檢測到BrdU抗體陽性，說明移植的ADSCs已成活。而對照組BrdU抗體檢測則呈陰性。
　　結(jié)論:
　　1.體外提取的脂肪干細(xì)胞(ADSCs)與顆粒脂肪混合，移植與裸鼠背部筋膜下后，其中一部分ADSCs轉(zhuǎn)化為了脂肪細(xì)胞，構(gòu)成受區(qū)有生命力的正常脂肪組織。
　　2.移植的脂肪干細(xì)胞可能通過旁分泌的方式促進(jìn)血管形成，加快移植脂肪組織的新生血管網(wǎng)的重建，從而保證移植脂肪組織有充足的血供，進(jìn)而降低移植脂肪組織的壞死及吸