南林895楊無選擇標(biāo)記遺傳轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、本文以南林895楊為試驗材料，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，利用構(gòu)建的可去除選擇標(biāo)記載體PX6-GFP和PX6-CpTI，開展楊樹無選擇標(biāo)記遺傳轉(zhuǎn)化的研究，分析轉(zhuǎn)化效率和選擇標(biāo)記基因去除效率，旨在為培育無選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因楊樹提供試驗依據(jù)，主要進(jìn)展如下： 1．構(gòu)建了可去除選擇標(biāo)記基因的植物表達(dá)載體PX6-CpTI。通過PCR擴增獲得載體pFZY1上的抗蟲基因CpTI，經(jīng)測序驗證和分析后，利用可去除選擇標(biāo)記載體系統(tǒng)PX6，構(gòu)建植物表達(dá)載體P

2、X6-CpTI。 2．獲得南林895楊轉(zhuǎn)基因植株。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的優(yōu)化的遺傳轉(zhuǎn)化體系，利用可去除標(biāo)記載體PX6-GFP和PX6-CpTI，開展南林895楊遺傳轉(zhuǎn)化研究。經(jīng)統(tǒng)計，共獲得PX6-GFPKm抗性植株51株，其中26株P(guān)CR檢測呈陽性；獲得PX6-CpTI Km抗性植株11株，其中6株P(guān)CR檢測呈陽性。 3．誘導(dǎo)去除選擇標(biāo)記基因。選取PCR檢測呈陽性的部分轉(zhuǎn)基因植株，將其置于含有5μM誘導(dǎo)物β-雌二醇的生根培養(yǎng)基

3、上，同時每隔3d向植株噴灑誘導(dǎo)液(1/2MS+β-雌二醇5μM)，持續(xù)30d。 4．選擇標(biāo)記基因的去除效率分析。對誘導(dǎo)后的轉(zhuǎn)基因植株采用PCR、DNA測序、GFP熒光檢測等方法進(jìn)行分析，證實了選擇標(biāo)記基因已在楊樹轉(zhuǎn)基因植株上被去除。在21棵轉(zhuǎn)基因植株中，檢測出已去除選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植株1棵，另有1棵為部分去除。 5．轉(zhuǎn)基因植株標(biāo)記基因去除后對Km敏感性測定。通過對轉(zhuǎn)基因植株誘導(dǎo)前后其葉盤對Km敏感性的對比試驗，發(fā)現(xiàn)經(jīng)誘導(dǎo)