骨保護素植物表達載體的構建及轉化.pdf

1、目的：構建骨保護素植物表達載體pZP211-Ubi-opg，將pZP211-opg轉入優(yōu)良玉米自交系昌7-2和18-599，以玉米作為生物反應器大量生產骨保護素。
　　 方法：opg位于克隆載體pMD18-T的EcoRV處，兩端設計帶有BamH I和Sac I酶切位點的引物，提取的含pMD18-T的大腸桿菌的質粒作為PCR擴增的模板擴增opg序列，用BamH I和Sac I分別雙酶切表達載體pZP211和擴增產物，回收大小片段并

2、連接，將opg定向克隆到表達載體pZP211 Ubi啟動子的下游，經酶切、PCR以及測序驗證克隆正確。以優(yōu)良玉米自交系昌7-2和18-599誘導出的愈傷組織為試材，通過基因槍轟擊法完成了pZP211-Ubi-opg基因的遺傳轉化，轉化后的愈傷組織經巴龍霉素(25mg/L、50mg/L、25mg/L)三輪篩選后分化成抗性苗，通過PCR、RT-PCR分子檢測獲得了轉基因植株。
　　 結果：通過PCR方法將目的基因opg從克隆載體pM

3、D18-T上擴增出來，利用酶切和連接技術成功將目的基因與表達載體連接，構建了人opg的植物表達載體pZP211-Ubi-opg；通過基因槍轟擊法將該表達載體成功地導入玉米自交系18-599和昌7-2的愈傷組織中，經篩選分化獲得抗性苗；分子檢測初步證明opg已整合入玉米基因組中。
　　 結論：成功構建了植物表達載體pZP211-Ubi-opg，完成了玉米的遺傳轉化，初步檢測確定目的基因已整合到玉米基因組中，獲得了含opg的18-5