基于RT-LAMP的口蹄疫病毒(FMDV)通用型快速檢測方法構建.pdf

1、口蹄疫（foot and mouth disease, FMD）是由口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus, FMDV）引起的一種動物傳染性疫病，主要侵染偶蹄類動物，以豬，牛，羊易感，偶見于人和其他動物。FMD致死率較高，幼年個體死亡率高達100％，感染后常不見癥狀而猝死，成年個體死亡率較低。目前，F(xiàn)MD對畜牧養(yǎng)殖業(yè)及人類健康構成巨大威脅，是世界動物衛(wèi)生組織（Office International des

2、 Epizooties, OIE）法定報告的動物傳染病之一。
　　FMDV為RNA病毒，變異較快，給疫苗研制帶來巨大困難。病原學檢測，血清學檢測，分子生物檢測等是常見的傳統(tǒng)檢測方法，但技術要求高，檢測周期長，在基層單位檢測及現(xiàn)場快速檢測中應用受限。
　　逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增技術（reverse transcription loop mediacted isothermal amplification, RT-LAMP）是一種

3、新技術，該技術操作簡單，反應快速，僅需一個水浴鍋，在一個小時內(nèi)就可以完成核酸的檢測。據(jù)此原理，本研究探索并建立了FMDV通用型RT-LAMP快速檢測方法。
　　主要研究結果如下：
　　1）引物設計：對O型，A型及亞洲Ⅰ型3種血清型FMDV全基因組序列進行比對，利用LAMP引物在線設計軟件primer explorer V5，設計40套RT-LAMP引物，根據(jù)LAMP評分原則等方法篩選出3套特異性引物，初步建立了FMD通用型R

4、T-LAMP檢測方法。
　　2）方法優(yōu)化：為提高RT-LAMP檢測效率，對反應體系進行優(yōu)化，最終確立的25μL的RT-LAMP最佳反應體系為：外引物（F3/B3）各12 mM，內(nèi)引物（FIP/BIP）各40mM，環(huán)引物（LF/LB）各35mM，鎂離子的濃度8 mM，甜菜堿的濃度為0.24 M，dNTP的濃度1.8 mM，BstDNA大片段聚合酶濃度6.4 U/μL，AMV反轉(zhuǎn)錄酶的濃度為0.16 U/μL，10×BstDNA大片段

5、聚合酶Buffer添加量2.5μL，染料添加量1μL，模板添加量2μL并用無菌雙蒸水補足體系。LAMP反應程序為：63℃，60 min；80℃，10min。
　　3）敏感性檢測：利用中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所（簡稱蘭獸研）提供的7種FMD代表毒株作為RT-LAMP敏感性檢測方法的模板，同時利用蘭獸研的FMD熒光檢測試劑盒作對比，本研究的ΔRn值高于蘭獸研檢測ΔRn值， RT-LAMP檢測方法敏感性高于蘭獸研 FMD熒光檢測試劑盒

6、敏感性。并且本研究方法對于目前國內(nèi)常見的O型FMDV毒株Mya-98和PanAsia，及A型毒株Sea-97 G2的敏感性較好。
　　4）靈敏度檢測：本研究所建立的檢測方法能夠同時檢測出三種血清型
　　FMDV，對O型的檢測靈敏度最高。分別以10倍梯度稀釋的O型，A型及亞洲Ⅰ型3種血清型FMDV核酸作模板，進行靈敏度檢測，其檢測下限分別是10-6，10-4和10-2。通過與OIE RT-qPCR檢測方法、蘭獸研FMDV檢測試

7、劑盒和中國動物疫病預防控制中心（簡稱疫控中心）RT-PCR方法作對比，O型檢測靈敏度高于OIE RT-qPCR檢測方法3個數(shù)量級，高于蘭獸研FMDV檢測試劑盒2個數(shù)量級，與疫控中心RT-PCR法接近；A型檢測靈敏度高于OIE RT-qPCR檢測方法和疫控中心 RT-PCR法2個數(shù)量級，與蘭獸研FMDV檢測試劑盒接近；亞洲Ⅰ型檢測靈敏度稍低于其它檢測方法。
　　5）特異性檢測：本方法特異性強，分別以O型，A型和亞洲Ⅰ型口蹄疫病毒核酸

8、、豬瘟病毒（classical swine fevervirus,CSFV）、豬圓環(huán)病毒（porci ne circovirus,PCV）、豬細小病毒（porcine parvovirus,PPV）、豬偽狂犬病毒（p orcine pseudorabies virus,PRV）、豬藍耳病毒（porcine reproductive and respir atory syndromevirus,PRRSV）、副豬嗜血桿菌（haemophi