幽門(mén)螺桿菌粘附素HLA限制性CD4+T細(xì)胞顯性表位鑒定及其免疫優(yōu)勢(shì)應(yīng)答研究.pdf

1、背景:
　　幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori, H. pylori)感染是人類(lèi)發(fā)生率最高的慢性細(xì)菌感染之一,全球50％以上的人存在著H. pylori感染,在中國(guó),感染者超過(guò)6億。H. pylori感染是引起慢性胃炎、消化性潰瘍、胃粘膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤等消化疾病的重要原因,并且與胃癌的發(fā)生緊密相關(guān)。目前臨床上抗H. pylori感染的主要手段是抗生素聯(lián)合質(zhì)子泵抑制劑治療,但隨著耐藥菌的不斷出現(xiàn)以及患者依從性差等

2、原因,H. pylori感染并未得到很好的控制。表位疫苗的出現(xiàn)為預(yù)防和治療H. pylori感染提供了新的策略。目前,全球已廣泛開(kāi)展了病毒及腫瘤表位疫苗的研究,而H. pylori表位疫苗的研究還處于起步階段。
　　H. pylori在感染機(jī)體后主要引起以CD4+ T淋巴細(xì)胞為主的免疫應(yīng)答。同時(shí)研究表明機(jī)體CD4+T細(xì)胞應(yīng)答對(duì)H. pylori感染的免疫保護(hù)是必需的。目前關(guān)于H. pylori感染后引起機(jī)體T細(xì)胞應(yīng)答的報(bào)道較多,但

3、主要聚焦在H. pylori全菌或單個(gè)抗原的層面,并未對(duì)抗原的優(yōu)勢(shì)應(yīng)答表位進(jìn)行鑒定。依據(jù)抗原表位刺激T細(xì)胞應(yīng)答能力的強(qiáng)弱, T細(xì)胞抗原表位可以分為:免疫優(yōu)勢(shì)表位和亞優(yōu)勢(shì)表位。宿主體內(nèi)抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答主要由免疫優(yōu)勢(shì)表位特異性應(yīng)答所主導(dǎo)。但抗原的免疫優(yōu)勢(shì)和亞優(yōu)勢(shì)T細(xì)胞表位不是固定不變的,不同宿主的MHC基因型不同,抗原的免疫優(yōu)勢(shì)表位也不完全相同。為提高疫苗的有效覆蓋率,以保護(hù)更大的人群,表位疫苗設(shè)計(jì)首先要考慮針對(duì)人群中出現(xiàn)頻率最高HLA

4、基因型進(jìn)行免疫優(yōu)勢(shì)表位的篩選,以進(jìn)一步用于表位疫苗的設(shè)計(jì)。
　　H. pylori粘附素A亞單位(H. pylori adhesion A subunit, HpaA)是H. pylori粘附定植的重要因子,其在H. pylori各菌株之間高度保守,被認(rèn)為是H. pylori疫苗設(shè)計(jì)的重要保護(hù)性候選抗原。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)HpaA免疫后能降低胃內(nèi)細(xì)菌定植量的保護(hù)性作用,且該保護(hù)作用由CD4+ T細(xì)胞應(yīng)答所介導(dǎo)。但HpaA特異性CD4

5、+ T細(xì)胞保護(hù)性應(yīng)答的顯性表位及其優(yōu)勢(shì)應(yīng)答特征仍需進(jìn)一步的研究。
　　目的:
　　1、明確中國(guó)漢族人群高頻 HLA基因型,計(jì)算機(jī)軟件預(yù)測(cè)各高頻 HLA基因型限制性HpaA來(lái)源的CD4 T細(xì)胞表位,并進(jìn)一步通過(guò)T細(xì)胞應(yīng)答分析對(duì)預(yù)測(cè)表位的免疫原性進(jìn)行驗(yàn)證。
　　2、系統(tǒng)分析不同HLA基因型H. pylori感染者中HpaA特異性CD4+T細(xì)胞的表位及其免疫優(yōu)勢(shì)應(yīng)答特征。
　　方法:
　　1、利用13C-尿素呼氣

6、試驗(yàn)和血清抗幽門(mén)螺桿菌抗體ELISA篩選H. pylori感染陽(yáng)性個(gè)體;利用PCR-SBT法對(duì)HLA-DRB1基因進(jìn)行分型;通過(guò)統(tǒng)計(jì)Allele Frequency Net數(shù)據(jù)庫(kù)中所有中國(guó)漢族人群HLA-DRB1基因型頻率確定高頻HLA-DRB1基因型;利用NetMHCIIpan軟件對(duì)高頻HLA-DRB1基因型限制性HpaA來(lái)源CD4+T細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測(cè);利用重組HpaA蛋白體外刺激擴(kuò)增建立HpaA特異性CD4+ T細(xì)胞系和合成短肽對(duì)預(yù)

7、測(cè)表位的免疫原性進(jìn)行鑒定;通過(guò)體外誘導(dǎo)的樹(shù)突狀細(xì)胞(Dentritic cell, DC)負(fù)載重組HpaA蛋白對(duì)表位的自然遞呈能力進(jìn)行驗(yàn)證。
　　2、利用重組HpaA蛋白體外刺激擴(kuò)增建立HpaA特異性CD4+T細(xì)胞系;利用步移重疊合成肽對(duì)優(yōu)勢(shì)抗原表位進(jìn)行篩選鑒定;利用 PCR-SBT基因分型、抗體阻斷和BLCL表位遞呈實(shí)驗(yàn)對(duì)HLA限制性進(jìn)行鑒定;通過(guò)多序列比對(duì)對(duì)表位序列保守性進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　結(jié)果:
　　1、中國(guó)漢族人群

8、出現(xiàn)頻率最高的3種 HLA-DRB1基因型分別是:HLA-DRB1*0901(14.4%),HLA-DRB1*1202(13.3%)和HLA-DRB1*1501(10.8%)。
　　2、 NetMHCIIpan預(yù)測(cè)上述三種 HLA基因型分子親和力最強(qiáng)的前8個(gè)表位分別是:HLA-DRB1*0901(HpaA39-53;HpaA42-56;HpaA78-92;HpaA85-99;HpaA92-106;HpaA117-131;HpaA1

9、75-189;HpaA194-208)、HLA-DRB1*1202(HpaA56-70;HpaA60-74;HpaA219-233;HpaA38-52;HpaA89-103; HpaA192-206; HpaA222-236; HpaA189-203)、 HLA-DRB1*1501(HpaA56-70;HpaA87-101;HpaA38-52;HpaA223-237;HpaA219-233;HpaA78-92;HpaA36-50;Hpa

10、A191-205)。
　　3、利用H. pylori感染者PBMC成功建立HpaA特異性CD4+ T細(xì)胞系,而未感染者PBMC不能成功建立HpaA特異性CD4+T細(xì)胞系。
　　4、通過(guò)T細(xì)胞刺激試驗(yàn)驗(yàn)證顯示3個(gè)具有免疫原性的HpaA特異性CD4+T細(xì)胞表位分別是:HpaA39-53(HLA-DRB1*0901)、HpaA89-103(HLA-DRB1*1202)、HpaA87-101(HLA-DRB1*1501)。
　

11、　5、經(jīng)DC自然遞呈實(shí)驗(yàn)證實(shí)上述3個(gè)表位均能被自然加工遞呈。
　　6、成功擴(kuò)增出的66例不同HLA基因型H. pylori感染者HpaA特異性CD4+T細(xì)胞應(yīng)答在不同個(gè)體間差異顯著,通過(guò)步移合成重疊肽法篩選出22個(gè)18mer免疫顯性表位,其中在HLA-DRB1*1501陰性個(gè)體中,HpaA142-159特異性CD4+ T細(xì)胞應(yīng)答出現(xiàn)頻率最高(23/66)。
　　7、表位HpaA142-159的核心序列是HpaA144-156

12、,受HLA-DRB1*0901分子限制。
　　8、HpaA144-156特異性 CD4+ T細(xì)胞應(yīng)答在8例攜帶 HLA-DRB1*0901基因的 H. pylori感染陽(yáng)性個(gè)體中有6例處于免疫優(yōu)勢(shì)地位。
　　9、經(jīng)BLCL自然遞呈實(shí)驗(yàn)證實(shí)HpaA144-156表位能被自然加工遞呈。
　　10、HpaA144-156在不同幽門(mén)螺桿菌菌株HpaA蛋白中高度保守。
　　結(jié)論:
　　1、表位 HpaA39-53(H

13、LA-DRB1*0901)、HpaA89-103(HLA-DRB1*1202)和 HpaA87-101(HLA-DRB1*1501)能夠引起對(duì)應(yīng)HLA基因型特異性CD4+T細(xì)胞應(yīng)答,并且能夠在自然感染狀態(tài)下被遞呈。
　　2、非HLA-DRB1*1501 H. pylori感染人群中,HpaA142-159作為免疫優(yōu)勢(shì)表位出現(xiàn)頻率最高,其核心表位是HpaA144-156,受HLA-DRB1*0901限制,能被抗原遞呈細(xì)胞自然加工遞呈

14、。HpaA144-156特異性CD4+ T細(xì)胞在HLA-DRB1*0901個(gè)體中處于免疫優(yōu)勢(shì)地位,且在不同H. pylori菌株蛋白序列中高度保守,可用于H. pylori表位疫苗的設(shè)計(jì)。
　　3、軟件預(yù)測(cè)能鑒定出一些具有免疫原性的CD4+T細(xì)胞表位,但不夠準(zhǔn)確,不能很好的對(duì)優(yōu)勢(shì)表位進(jìn)行鑒定。步移重疊合成肽法能對(duì)HpaA特異性CD4+ T細(xì)胞顯性表位及其免疫優(yōu)勢(shì)應(yīng)答進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定。
　　意義:
　　本研究對(duì)計(jì)算機(jī)軟件預(yù)