幽門螺桿菌粘附素HLA限制性CD4+T細胞顯性表位鑒定及其免疫優(yōu)勢應答研究.pdf

1、背景:
　　幽門螺桿菌(Helicobacter pylori, H. pylori)感染是人類發(fā)生率最高的慢性細菌感染之一,全球50％以上的人存在著H. pylori感染,在中國,感染者超過6億。H. pylori感染是引起慢性胃炎、消化性潰瘍、胃粘膜相關淋巴組織淋巴瘤等消化疾病的重要原因,并且與胃癌的發(fā)生緊密相關。目前臨床上抗H. pylori感染的主要手段是抗生素聯合質子泵抑制劑治療,但隨著耐藥菌的不斷出現以及患者依從性差等

2、原因,H. pylori感染并未得到很好的控制。表位疫苗的出現為預防和治療H. pylori感染提供了新的策略。目前,全球已廣泛開展了病毒及腫瘤表位疫苗的研究,而H. pylori表位疫苗的研究還處于起步階段。
　　H. pylori在感染機體后主要引起以CD4+ T淋巴細胞為主的免疫應答。同時研究表明機體CD4+T細胞應答對H. pylori感染的免疫保護是必需的。目前關于H. pylori感染后引起機體T細胞應答的報道較多,但

3、主要聚焦在H. pylori全菌或單個抗原的層面,并未對抗原的優(yōu)勢應答表位進行鑒定。依據抗原表位刺激T細胞應答能力的強弱, T細胞抗原表位可以分為:免疫優(yōu)勢表位和亞優(yōu)勢表位。宿主體內抗原特異性T細胞應答主要由免疫優(yōu)勢表位特異性應答所主導。但抗原的免疫優(yōu)勢和亞優(yōu)勢T細胞表位不是固定不變的,不同宿主的MHC基因型不同,抗原的免疫優(yōu)勢表位也不完全相同。為提高疫苗的有效覆蓋率,以保護更大的人群,表位疫苗設計首先要考慮針對人群中出現頻率最高HLA

4、基因型進行免疫優(yōu)勢表位的篩選,以進一步用于表位疫苗的設計。
　　H. pylori粘附素A亞單位(H. pylori adhesion A subunit, HpaA)是H. pylori粘附定植的重要因子,其在H. pylori各菌株之間高度保守,被認為是H. pylori疫苗設計的重要保護性候選抗原。動物實驗結果證實HpaA免疫后能降低胃內細菌定植量的保護性作用,且該保護作用由CD4+ T細胞應答所介導。但HpaA特異性CD4

5、+ T細胞保護性應答的顯性表位及其優(yōu)勢應答特征仍需進一步的研究。
　　目的:
　　1、明確中國漢族人群高頻 HLA基因型,計算機軟件預測各高頻 HLA基因型限制性HpaA來源的CD4 T細胞表位,并進一步通過T細胞應答分析對預測表位的免疫原性進行驗證。
　　2、系統分析不同HLA基因型H. pylori感染者中HpaA特異性CD4+T細胞的表位及其免疫優(yōu)勢應答特征。
　　方法:
　　1、利用13C-尿素呼氣

6、試驗和血清抗幽門螺桿菌抗體ELISA篩選H. pylori感染陽性個體;利用PCR-SBT法對HLA-DRB1基因進行分型;通過統計Allele Frequency Net數據庫中所有中國漢族人群HLA-DRB1基因型頻率確定高頻HLA-DRB1基因型;利用NetMHCIIpan軟件對高頻HLA-DRB1基因型限制性HpaA來源CD4+T細胞表位進行預測;利用重組HpaA蛋白體外刺激擴增建立HpaA特異性CD4+ T細胞系和合成短肽對預

7、測表位的免疫原性進行鑒定;通過體外誘導的樹突狀細胞(Dentritic cell, DC)負載重組HpaA蛋白對表位的自然遞呈能力進行驗證。
　　2、利用重組HpaA蛋白體外刺激擴增建立HpaA特異性CD4+T細胞系;利用步移重疊合成肽對優(yōu)勢抗原表位進行篩選鑒定;利用 PCR-SBT基因分型、抗體阻斷和BLCL表位遞呈實驗對HLA限制性進行鑒定;通過多序列比對對表位序列保守性進行評價。
　　結果:
　　1、中國漢族人群

8、出現頻率最高的3種 HLA-DRB1基因型分別是:HLA-DRB1*0901(14.4%),HLA-DRB1*1202(13.3%)和HLA-DRB1*1501(10.8%)。
　　2、 NetMHCIIpan預測上述三種 HLA基因型分子親和力最強的前8個表位分別是:HLA-DRB1*0901(HpaA39-53;HpaA42-56;HpaA78-92;HpaA85-99;HpaA92-106;HpaA117-131;HpaA1

9、75-189;HpaA194-208)、HLA-DRB1*1202(HpaA56-70;HpaA60-74;HpaA219-233;HpaA38-52;HpaA89-103; HpaA192-206; HpaA222-236; HpaA189-203)、 HLA-DRB1*1501(HpaA56-70;HpaA87-101;HpaA38-52;HpaA223-237;HpaA219-233;HpaA78-92;HpaA36-50;Hpa

10、A191-205)。
　　3、利用H. pylori感染者PBMC成功建立HpaA特異性CD4+ T細胞系,而未感染者PBMC不能成功建立HpaA特異性CD4+T細胞系。
　　4、通過T細胞刺激試驗驗證顯示3個具有免疫原性的HpaA特異性CD4+T細胞表位分別是:HpaA39-53(HLA-DRB1*0901)、HpaA89-103(HLA-DRB1*1202)、HpaA87-101(HLA-DRB1*1501)。
　

11、　5、經DC自然遞呈實驗證實上述3個表位均能被自然加工遞呈。
　　6、成功擴增出的66例不同HLA基因型H. pylori感染者HpaA特異性CD4+T細胞應答在不同個體間差異顯著,通過步移合成重疊肽法篩選出22個18mer免疫顯性表位,其中在HLA-DRB1*1501陰性個體中,HpaA142-159特異性CD4+ T細胞應答出現頻率最高(23/66)。
　　7、表位HpaA142-159的核心序列是HpaA144-156

12、,受HLA-DRB1*0901分子限制。
　　8、HpaA144-156特異性 CD4+ T細胞應答在8例攜帶 HLA-DRB1*0901基因的 H. pylori感染陽性個體中有6例處于免疫優(yōu)勢地位。
　　9、經BLCL自然遞呈實驗證實HpaA144-156表位能被自然加工遞呈。
　　10、HpaA144-156在不同幽門螺桿菌菌株HpaA蛋白中高度保守。
　　結論:
　　1、表位 HpaA39-53(H

13、LA-DRB1*0901)、HpaA89-103(HLA-DRB1*1202)和 HpaA87-101(HLA-DRB1*1501)能夠引起對應HLA基因型特異性CD4+T細胞應答,并且能夠在自然感染狀態(tài)下被遞呈。
　　2、非HLA-DRB1*1501 H. pylori感染人群中,HpaA142-159作為免疫優(yōu)勢表位出現頻率最高,其核心表位是HpaA144-156,受HLA-DRB1*0901限制,能被抗原遞呈細胞自然加工遞呈

14、。HpaA144-156特異性CD4+ T細胞在HLA-DRB1*0901個體中處于免疫優(yōu)勢地位,且在不同H. pylori菌株蛋白序列中高度保守,可用于H. pylori表位疫苗的設計。
　　3、軟件預測能鑒定出一些具有免疫原性的CD4+T細胞表位,但不夠準確,不能很好的對優(yōu)勢表位進行鑒定。步移重疊合成肽法能對HpaA特異性CD4+ T細胞顯性表位及其免疫優(yōu)勢應答進行系統的鑒定。
　　意義:
　　本研究對計算機軟件預