K-ras基因RNA干擾對(duì)胰腺癌細(xì)胞株增殖凋亡和信號(hào)通路的影響.pdf

1、背景：胰腺癌是目前已知惡性程度最高的腫瘤之一，它生長(zhǎng)迅速，早期癥狀隱匿，發(fā)現(xiàn)時(shí)多已發(fā)生轉(zhuǎn)移，且對(duì)化療藥物敏感性不好，目前唯一證實(shí)有效的治療方法是手術(shù)切除。然而，由于發(fā)現(xiàn)多為晚期，只有少數(shù)病人有手術(shù)機(jī)會(huì)，且即使是術(shù)后5年生存率也在12％～20％之間。在西方國(guó)家，胰腺癌已列死亡率最高的惡性腫瘤第4位。
　　 胰腺癌的病因目前仍未研究清楚，多種環(huán)境因素和多個(gè)基因異常被認(rèn)為在其發(fā)生過(guò)程中起作用。其中，癌基因的激活和抑癌基因的失活起到了重

2、要作用。K-ras基因是胰腺癌發(fā)生發(fā)展中最為重要的原癌基因。K-ras蛋白是小分子G蛋白，當(dāng)它與GTP結(jié)合時(shí)為活性狀態(tài)，可進(jìn)一步激活下游信號(hào)通路，調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖。正常情況下，Ras蛋白是一類(lèi)在組織中廣泛存在的信號(hào)通路中心分子，具有重要生理功能。當(dāng)Ras蛋白突變時(shí)，構(gòu)型改變，始終處于被激活的“鎖定”狀態(tài)，不需外界生長(zhǎng)信號(hào)就可以持續(xù)激活下游信號(hào)分子，導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)節(jié)制地異常增殖，最終發(fā)生腫瘤。本實(shí)驗(yàn)室多年來(lái)研究一個(gè)與K-ras基因具有同源性

3、，而功能相反的抑癌基因ARHI，研究表明其作用可能通過(guò)抑制Ras經(jīng)典信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)，甚至可以抑制Ras基因的表達(dá)。其與Ras相互作用的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
　　 K-ras基因的突變類(lèi)型多為點(diǎn)突變，尤以第一外顯子的第12位密碼子點(diǎn)突變最為多見(jiàn)。由于其為胰腺癌發(fā)生中的早期事件，又有突變頻率高，突變類(lèi)型固定的特點(diǎn)，臨床上已將該位點(diǎn)作為胰腺癌早期診斷的新的分子標(biāo)志物之一。此外，人們也希望將該位點(diǎn)作為胰腺癌早期治療的新的靶點(diǎn)。RNA干擾技

4、術(shù)的出現(xiàn)，給這種希望賦予了更大的可能。其高度特異性降解目標(biāo)mRNA的特性，可特異性針對(duì)突變型的K-ras基因產(chǎn)生效應(yīng)，而保留正常K-ras基因的功能。目前已有許多體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行這方面的嘗試。
　　 目的：對(duì)K-ras突變型胰腺癌細(xì)胞系，特異性敲除K-ras基因，觀察對(duì)胰腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響，初步探討K-ras下游信號(hào)通路的改變情況，同時(shí)觀察ARHI表達(dá)的情況。
　　 方法：應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，

5、采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染小干擾RNA（siRNA）的方法，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PANC-1、MiaPaCa-2兩株細(xì)胞系，通過(guò)熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀測(cè)定轉(zhuǎn)染率。優(yōu)化條件后從RNA和蛋白水平驗(yàn)證K-ras基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平。繼而觀察K-ras干擾前后胰腺癌細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的變化，以及K-ras相關(guān)的下游經(jīng)典信號(hào)通路Ras-Raf-ERK和Ras-PI-3K/AKT中的核心蛋白ERK和AKT的表達(dá)情況。以CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑檢測(cè)細(xì)胞增殖；以

6、流式細(xì)胞儀PI染色法測(cè)定細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期；以凋亡小體染色和吖啶橙染色觀察干擾后細(xì)胞凋亡增多的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)；以熒光實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證K-ras表達(dá)下調(diào)情況下細(xì)胞周期相關(guān)因子Cyclin A和Cyclin E以及ARHI等的mRNA相對(duì)定量情況；以Western Blot檢測(cè)功能性ERK、功能性AKT和總AKT，以及與AKT調(diào)控有關(guān)的抑癌基因p53的蛋白水平和ARHI蛋白水平變化。結(jié)果：脂質(zhì)體介導(dǎo)的siRNA轉(zhuǎn)染效率在兩個(gè)細(xì)胞株均可達(dá)90％

7、以上。針對(duì)K-ras突變類(lèi)型設(shè)計(jì)的siRNA可特異性敲除相應(yīng)的K-ras基因，而不干擾其他突變類(lèi)型。24h和48h提取的RNA均隨siRNA濃度升高產(chǎn)生明顯K-ras mRNA下調(diào)，siRNA終濃度達(dá)100nM時(shí)干擾效果最明顯。干擾：K-ras之后，MiaPaCa-2細(xì)胞增殖受到明顯抑制，重復(fù)測(cè)量方差分析p<0.05，PANC-1細(xì)胞差異未達(dá)顯著。兩株細(xì)胞系的凋亡率均增加，干擾組PANC-1、MiaPaCa-2凋亡細(xì)胞的百分率分別為22

8、.6％和32.1％，相對(duì)于對(duì)照組的9.7％和17.3％有顯著性差異（p<0.05）。凋亡形態(tài)學(xué)觀察可以得出相同的結(jié)論。細(xì)胞周期發(fā)生停滯，G1期增加，S期和G2期減少，PANC.1和MiaPaCa-2的G1期比例分別由50.4％、58.7％上升到65.1％和67.4％；S期由32.4％、26.5％下降至21.8％、21.7％；兩期的變化有明顯差異，p<0.05，而G2期差異不顯著；細(xì)胞周期相關(guān)因子Cyclin A和Cyclin E在mRN

9、A水平有下降趨勢(shì)，除MiaPaCa-2的cyclin A相對(duì)水平降至0.4.以外，其余下降幅度均未達(dá)50％。p-ERK、p-AKT蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，而總AKT無(wú)明顯變化；p53表達(dá)明顯上調(diào)。蛋白水平變化于96h時(shí)更為明顯。ARHI蛋白在干擾后仍無(wú)表達(dá)，熒光實(shí)時(shí)定量PCR有差異，但因表達(dá)量太低，差異不明確。結(jié)論：對(duì)胰腺癌細(xì)胞株瞬時(shí)轉(zhuǎn)染特異性siRNA可特異性干擾K-rag突變序列，使MiaPaCa-2細(xì)胞增殖受到抑制，兩株細(xì)胞凋亡增加，細(xì)