β1,3-N-乙酰氨基葡萄糖基轉移酶(β3Gn-T8)對人腦星形膠質瘤侵襲和增殖的影響.pdf

1、本研究旨在探討β1，3-N-乙酰氨基葡萄糖基轉移酶8(β3Gn-T8)對膠質瘤侵襲及增殖的影響。通過對膠質瘤細胞惡性表型相關因子、成瘤模型及臨床標本的相關指標檢測分析，來了解β3Gn-T8在膠質瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演的重要作用，為治療人惡性膠質瘤提供一個新的有效的輔助分子治療方法。
　　 目的:
　　 (1)探討糖基轉移酶β3Gn-T8在人腦膠質瘤組織與正常腦組織中表達的差異。
　　 (2)在人膠質瘤U251細胞水平

2、探討糖基轉移酶β3Gn-T8對膠質瘤侵襲及增殖能力的影響，以及β3Gn-T8與MMP-2的關系。
　　 (3)觀察糖基轉移酶β3Gn-T8對膠質瘤U251細胞裸鼠皮下種植瘤生長的影響。
　　 (4)探討糖基轉移酶β3Gn-T8對腫瘤細胞多聚乳糖胺鏈的影響。
　　 方法:
　　 (1)運用免疫組織化學方法，在人腦星形膠質瘤和正常腦組織的石蠟標本上，分別檢測β3Gn-T8的表達情況并分析其差異。收集相關膠質瘤

3、組織標本的臨床病理參數(shù)，通過統(tǒng)計學方法分析膠質瘤β3Gn-T8表達與臨床病理參數(shù)的關系。
　　 (2)將β3Gn-T8的真核表達正義載體pEGFP-C1-T8及空載體pEGFP-C1、RNA干擾載體pSilenCircle-T8Si及對照載體pSilenCircle-T8Scr，通過脂質體轉入人星形膠質瘤U251細胞，經G418篩選出穩(wěn)定細胞株，RT-PCR挑選出上調、下調β3Gn-T8最優(yōu)的細胞株。將細胞分為五組:U251轉染

4、正義載體組(T8S)與空載體組(Mock)、U251轉染干擾載體組(T8Si)與對照載體組(T8Scr)、U251未轉染組(NC)。RT-PCR、Western blot及免疫熒光檢測五組細胞β3Gn-T8的表達，并用流式細胞術分析β3Gn-T8高/低表達細胞株的多聚乳糖胺鏈的變化。
　　 (3)在體外實驗中，通過MTT檢測以上各組細胞生長狀況，集落形成實驗檢測各組細胞單細胞形成集落的能力;Boyden小室和劃痕修復實驗檢測各組

5、細胞侵襲遷移能力差異;采用RT-PCR及Western blot方法檢測以上五組細胞的MMP-2、TIMP-2 mRNA及蛋白水平表達變化。
　　 (4)在體內實驗中，將轉染正義載體組(T8S)、干擾載體組(T8Si)及未轉染組(NC)的U251細胞通過皮下接種BALB/c裸鼠的方法構建膠質瘤移植瘤模型。通過對移植瘤成瘤時間、生長曲線和最終體積指標的測量以及病理學觀察，探討β3Gn-T8對膠質瘤移植瘤增殖和侵襲能力的影響。

6、>　　 結果:
　　 (1)臨床人腦星形膠質瘤組織中β3Gn-T8蛋白表達陽性率為88.10％，顯著高于正常腦組織12.5％(P＜0.01)，且β3Gn-T8蛋白的表達與膠質瘤的臨床病理分級正相關(P＜0.05)。
　　 (2)通過RT-PCR和Western blot的檢測，以及激光共聚焦顯微鏡觀察各組細胞，可見載體成功轉入人星形膠質瘤U251細胞，得到穩(wěn)定轉染細胞株。同時，流式細胞術顯示，上調B3Gn-T8的表達水

7、平，多聚乳糖胺鏈產量增加，下調β3Gn-T8的表達水平，多聚乳糖胺鏈產量減少。
　　 (3)對轉染pEGFP-Cl-T8的U251細胞進行侵襲和增殖能力的系列檢測，和空載體組相比較，MTT檢測顯示細胞的增殖能力升高(P＜0.05)，集落形成實驗顯示細胞集落形成能力增強;Boyden小室實驗和劃痕修復實驗發(fā)現(xiàn)細胞的侵襲遷移能力增強(P＜0.05);RT-PCR及Western blot檢測發(fā)現(xiàn)MMP-2的表達在mRNA水平及蛋白水

8、平相應升高(P＜0.05)，而TIMP-2的表達不存在統(tǒng)計學意義。
　　 對轉染pSilenCircle-T8Si的U251細胞進行侵襲和增殖能力的系列檢測，和對照載體組相比較，MTT檢測顯示細胞的增殖能力下降(P＜0.05)，集落形成實驗顯示細胞集落數(shù)明顯降低;Boyden小室實驗發(fā)現(xiàn)細胞穿膜率較低，侵襲能力弱(P＜0.05)，劃痕修復實驗顯示細胞劃痕修復較慢，遷移能力下降(P＜0.05);RT-PCR及Western blo

9、t檢測發(fā)現(xiàn)MMP-2的表達在mRNA水平及蛋白水平相應降低(P＜0.05)，而TIMP-2的表達不存在統(tǒng)計學意義。
　　 (4)人星形膠質瘤U251細胞裸鼠移植瘤成瘤率100％。與NC組相比，T8S組移植瘤成瘤時間較短，生長速度較快，最終體積更大(P＜0.05); T8Si組移植瘤成瘤時間延長，其生長速度和最終體積均小于NC組(P＜0.05)。移植瘤組織學呈現(xiàn)典型的惡性腫瘤細胞形態(tài)特點，且T8S組的移植瘤細胞向周圍肌肉組織侵襲生

10、長。
　　 結論:
　　 (1)B3Gn-T8在人星形膠質瘤組織的表達較正常腦組織顯著增加，其表達與膠質瘤的臨床病理分級正相關。
　　 (2)成功構建了穩(wěn)定的β3Gn-T8上調及下調細胞株。
　　 (3)β3G n-T8促進了多聚乳糖胺鏈的合成。
　　 (4)β3Gn-T8增強了人星形膠質瘤U251細胞的增殖和侵襲能力。
　　 (5)在細胞水平，隨著β3Gn-T8表達的上調，MMP-2的表

11、達也相應升高，而TIMP-2表達水平不存在統(tǒng)計學意義。β3Gn-T8可能通過促使多聚乳糖胺鏈的合成，影響MMP-2/TIMP-2比值，打亂了兩者間的平衡，而促進了U251細胞的增殖和侵襲能力。
　　 (6)β3Gn-T8增強了膠質瘤裸鼠移植瘤的增殖和侵襲能力。
　　 綜上所述，糖基轉移酶β3Gn-T8在人膠質瘤組織的表達與膠質瘤的臨床病理分級正相關;糖基轉移酶β3Gn-T8對膠質瘤細胞的增殖和侵襲能力有增強作用;糖基轉移