雙抗原夾心ELISA檢測(cè)丙型肝炎病毒總抗體的初步研究.pdf

1、丙型肝炎病毒(HCV)所致的丙型肝炎(HC)是一種危害嚴(yán)重的傳染病，HCV感染呈世界性分布，在我國(guó)HCV感染者約有4000萬。為了控制HCV經(jīng)血液傳播，國(guó)家要求對(duì)獻(xiàn)血者進(jìn)行抗-HCV的檢測(cè)。目前國(guó)內(nèi)外HCV抗體檢測(cè)試劑均已開發(fā)了三代產(chǎn)品。第三代ELISA檢測(cè)試劑的質(zhì)量，較前兩代均有了很大提高，但還存在一定程度的漏檢和假陽性，如何提高HCV抗體試劑的質(zhì)量仍是一個(gè)亟待解決的問題。 在ELISA方法上，目前抗-HCV檢測(cè)試劑均采用間接

2、法，即用酶免疫標(biāo)記的抗人IgG為第二抗體，檢測(cè)血清中卜ICV抗體IgG。由于IgG抗體出現(xiàn)時(shí)間較晚，對(duì)早期感染易產(chǎn)生漏檢；同時(shí)，由于血清中非特異性物質(zhì)的吸附及類風(fēng)濕因子等干擾，容易產(chǎn)生假陽性反應(yīng)；另外，ELISA試劑盒使用的許多基因工程表達(dá)抗原都有融合末端，其抗原性可影響抗體檢測(cè)，有時(shí)也會(huì)產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。 而雙抗原夾心法ELISA使用的試劑從根本上更換了酶結(jié)合物質(zhì)，使得試劑對(duì)受檢樣品的特異性大大提高；同時(shí)，雙抗原夾心法ELISA

3、檢測(cè)的是總抗體，除IgG之外，還可以檢測(cè)到IgM、IgA等。在感染早期，由于IgM抗體比IgG出現(xiàn)早，雙抗原夾心法就可以縮短檢測(cè)的窗口期，因而此種方法檢測(cè)的敏感性高。應(yīng)用雙抗原夾心ELISA法來代替間接ELISA法，可以大大提高診斷試劑的敏感性與特異性，此法己在乙肝表面抗體、梅毒抗體、HlV抗體等的檢測(cè)中得到了成功的應(yīng)用，但在抗-HCV的檢測(cè)中目前還處于研究階段。 我們采用HCV 1-5基因型嵌合NS4抗原代替單一基因型的NS4

4、抗原，以減少由于HCv基因變異對(duì)檢測(cè)可能造成的影響；用融合六個(gè)組氨酸的抗原來包被酶標(biāo)板，用融合GST的抗原來作酶標(biāo)抗原，以消除融合末端對(duì)檢測(cè)的影響。通過這些改進(jìn)，本研究旨在建立一種敏感性高、特異性強(qiáng)的HCV雙抗原夾心ELISA檢測(cè)法，并初步探討其在HCV抗體檢測(cè)中的意義。本研究分為如下兩個(gè)部分： 一、HCV不同基因編碼區(qū)重組質(zhì)粒的構(gòu)建與重組抗原的表達(dá)和純化： 以能表達(dá)lItCV core、NS3和NS4 GST融合蛋白的

5、三種重組質(zhì)粒C-pGEX-4T-2、NS3-pGEX-4T-2和NS4-pGEX-4T-2為模板，分別構(gòu)建了能表達(dá)HCV core、NS3和NS4 His融合蛋白的另外三種重組表達(dá)質(zhì)粒C-pET-28a-c(+)、NS3-pET-28a-c(+)和NS4-pET-28a-c(+)；重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和雙酶切鑒定，各重組質(zhì)粒構(gòu)建成功；重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果顯示，插入的片段大小及閱讀框架全部正確；從IPTG濃度、誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間與溫度三個(gè)方面對(duì)蛋白表達(dá)

6、條件進(jìn)行了優(yōu)化：用NTA.Ni柱純化融合六個(gè)組氨酸的HCV重組抗原(H-C、H-NS3和H-NS4)，用Glutathione Sepharose<'TM>柱子純化融合GST的重組抗原(G-C、G-NS3和G-NS4).最后經(jīng)SDS-PAGE鑒定，純化到的六種HCV重組抗原純度均較高，經(jīng)蛋白定量測(cè)定后濃度分別為：H-C為1.35mg/ml(尿素變性)；G-C為0.812mg/ml；H-NS3為1.14mg/ml；G-NS3為1.31mg

7、/ml；H-NS4為3.28mg/ml(尿素變性)；G-NS4為1.62mg/ml。 二、HCV抗原的HRP標(biāo)記以及HCV抗體雙抗原夾心ELISA的建立與評(píng)價(jià)： 采用改良過碘酸鈉法，標(biāo)記了三種HCV重組抗原(G-C、G-NS3和G-NS4)。使用已知抗-HCV陽性混合血清和陰性混合血清，從包被抗原、酶標(biāo)記抗原二個(gè)方面進(jìn)行方陣滴定，建立了單片段抗原夾心ELISA。方陣滴定結(jié)果顯示，抗-HCV的C抗體檢測(cè)時(shí)，包被抗原H-C的

8、濃度為30μg/ml，酶標(biāo)抗原G-C稀釋度為1:3000；抗-HCV的NS4抗體檢測(cè)時(shí)，包被抗原H-NS4濃度為30 μg/ml，酶標(biāo)抗原G-NS4稀釋度為1:1000；抗-HCV的NS3抗體檢測(cè)時(shí)，包被抗原H-NS3濃度為30 μg/ml，酶標(biāo)抗原G-NS3稀釋度為1:1000。單片段夾心ELISA方陣滴定結(jié)果，可以得出的結(jié)論是酶標(biāo)抗原G-C的工作稀釋度分別是G-NS3、G-NS4的三倍，而G-NS3、G-NS4工作稀釋度相同。

9、 用己知抗-HCV陽性混合血清和陰性混合血清lOOul/孔；抗原H-C、H-NS3、H-NS4按摩爾比1:1:0.5的比例混合用作包被抗原；標(biāo)記后的抗原混合比例與包被抗原的混合比例相對(duì)應(yīng)，按1:3:1.5(根據(jù)單片段抗原夾心ELISA方陣滴定結(jié)果求得)混合作第二抗原，重新方陣滴定，建立了雙抗原夾心ELISA。方陣滴定結(jié)果顯示，混合包被抗原工作濃度為50μg/ml，混合酶標(biāo)抗原的工作稀釋度為1:200。同時(shí)，分別從包被緩沖液、聚苯乙烯微

10、孔板、封閉液、酶標(biāo)抗原稀釋液、標(biāo)本稀釋度等方面，優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)條件。 用間接ELISA(萬泰試劑)與雙抗原夾心ELISA，同時(shí)檢測(cè)了收集自南京市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科的1968份血清標(biāo)本，其中有17份血清標(biāo)本在兩種檢測(cè)方法中檢測(cè)結(jié)果不相符，又用HCV RNA套式RT-PCR檢測(cè)了這17份血清標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)14份間接法抗體陽性而雙抗原夾心法陰性的血清標(biāo)本中只有1份標(biāo)本的HCV RNA陽性，3份間接法陰性而夾心法陽性的血清標(biāo)本中有2份標(biāo)本的HC

11、V RNA陽性。雙抗原夾心法與間接ELISA法總體符合率為99.1％；以兩種ELISA檢測(cè)抗-HCV均陽性為HCV真陽性，而以兩種ELISA檢測(cè)抗-HCV均陰性為真陰性，再結(jié)合套式RT-PCR的結(jié)果，可以得出：來自二院的這1968份血清標(biāo)本中，HCV的感染率為9.8％(193P1968)；本實(shí)驗(yàn)所建立的雙抗原夾心法ELISA與間接法ELISA(北京萬泰)的敏感性分別為99.4％和98.9％；特異性分別為99.9％和99.2％。

12、此外，用套式RT-PCR檢測(cè)了31份間接法與夾心ELISA法抗-HCV均陽性的血清標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)有23份血清HCV RNA陽性，HCV RNA陽性率為74.2％(23/31)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于14份間接法抗體陽性而雙抗原夾心法陰性的血清標(biāo)本的陽性率7.1％(1/14)。提示間接法檢測(cè)抗-HCV IgG可能存在一定比例的假陽性。 綜上所述，我們建立的檢測(cè)HCV抗體的雙抗原夾心法ELISA具有較高的敏感性和特異性，有望用于臨床HCV感染的診斷和