基因芯片在病毒性肝炎分子診斷及基因表達(dá)譜研究中的應(yīng)用.pdf

1、肝炎病毒是引起急慢病毒性肝炎的主要致病原因之一，全球范圍內(nèi)有5億多人感染了慢性肝炎。病毒性肝炎傳染性強(qiáng)、傳播途徑復(fù)雜、流行面廣和發(fā)病率高，可演變?yōu)槁愿窝?、肝硬化以及肝?xì)胞癌(HepatocellularCarcinoma,HCC)。建立早期、敏感的方法對(duì)肝炎的診斷和預(yù)防將是目前控制肝炎繼續(xù)發(fā)展的重要途徑。乙型病毒性肝炎在我國(guó)是高流行區(qū)，已成為一個(gè)重要的健康問(wèn)題，年發(fā)病率為158/10萬(wàn)，現(xiàn)患慢性肝炎的病人約為1800萬(wàn)人，其中40％的

2、患者逐漸發(fā)展為更為嚴(yán)重的各種肝并發(fā)癥，包括肝硬化和HCC等，而受乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染的人群罹患HCC的相對(duì)危險(xiǎn)性比正常人群至少增加300倍；丙型肝炎在我國(guó)整體人群流行率為1～3％，丙型肝炎病毒(HCV)感染約70％～80％會(huì)轉(zhuǎn)為慢性，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于乙型肝炎的慢性化率(5％～10％)，約20％會(huì)發(fā)展成肝硬化，其中約5％在20～30年內(nèi)發(fā)展為HCC。到目前為此，沒(méi)有十分有效的方法來(lái)防止和控制HCV的感染，也沒(méi)有較為有效的疫苗，所以建立早

3、期診斷HCV感染的方法十分重要。HCV有多種基因型，不同HCV基因型感染所致疾病的嚴(yán)重程度不同，1型及混合型較重，2型較輕，不同基因型對(duì)干擾素(IFN)應(yīng)答及病毒血癥水平存在差異；丁型肝炎病毒(HDV)是一種缺陷病毒，需要HBV的輔助才能感染和復(fù)制。乙型肝炎患者重疊感染HDV，常導(dǎo)致肝炎的重型化和慢性化。 雖然許多HBV感染的分子機(jī)理研究都證實(shí)，HBV感染肝細(xì)胞后，誘導(dǎo)的肝損傷并非只是病毒的直接細(xì)胞毒作用，而是主要激活宿主免疫應(yīng)

4、答反應(yīng)，但病毒感染及其致病機(jī)理仍不十分清楚，與肝細(xì)胞之間相互作用的分子機(jī)制也了解很少。近年來(lái)，逐漸從局限于研究病毒基因結(jié)構(gòu)和功能轉(zhuǎn)向?qū)Σ《舅拗飨嗷リP(guān)系的研究，病毒編碼的蛋白能夠影響肝細(xì)胞某些基因的表達(dá)從而影響細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)可能是病毒感染致病及最終致癌的重要因素。肝炎蛋白的表達(dá)不僅對(duì)于HBV的生活周期具有重要意義，而且對(duì)于肝細(xì)胞基因表達(dá)譜產(chǎn)生重要影響。例如有研究顯示，HBV的X基因編碼產(chǎn)物(HbxAg)是一種具有反式激活作用的病毒蛋白，能夠

5、影響細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，激活多種病毒及細(xì)胞基因啟動(dòng)子，影響細(xì)胞分化與增殖，在HBV感染與HCC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮十分重要作用。但是由于肝炎病毒與宿主細(xì)胞和機(jī)體相互作用關(guān)系的多樣性和復(fù)雜性，傳統(tǒng)常用的從單個(gè)或幾個(gè)特定的因素研究病毒感染對(duì)宿主的影響，不足以找到規(guī)律性的結(jié)果，有必要引入新的策略和技術(shù)。 目前臨床上肝炎病毒診斷主要方法有免疫學(xué)上傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)及分子生物學(xué)方法等。ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)的對(duì)象是抗原和抗體

6、，由于人體對(duì)肝炎病毒產(chǎn)生免疫應(yīng)答有“窗口期”，所以人體對(duì)病毒感染免疫應(yīng)答有一定遲滯，對(duì)無(wú)免疫應(yīng)答或免疫力低下者的檢測(cè)更存在困難。另外，檢測(cè)的特異性和敏感性也不夠好。近年來(lái)發(fā)展的各種核酸雜交方法和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法各具優(yōu)點(diǎn)，可對(duì)其進(jìn)行定性、分型、半定量和定量檢測(cè)，不過(guò)核酸雜交雖有一定的特異性，但敏感性較低；而PCR操作容易造成交叉污染，假陽(yáng)性、假陰性結(jié)果經(jīng)常出現(xiàn)，且存在操作較繁瑣、一次檢測(cè)的病毒種類(lèi)、型別有限、檢測(cè)的效率和自動(dòng)化程

7、度不高。因而發(fā)展更有效、更科學(xué)、更直接、簡(jiǎn)化的方法，用于肝炎病毒的臨床檢測(cè)、分型十分必要。 基因芯片技術(shù)是上世紀(jì)90年代興起，源于計(jì)算機(jī)集成化芯片理念的一門(mén)新技術(shù)。實(shí)質(zhì)就是利用Southernblot原理，以可尋址的方式在載體表面，有序地點(diǎn)陣排列大量DNA雙鏈或oligo探針。這些被固定在基質(zhì)的探針就形成了高密度DNA微陣列。樣品DNA或RNA經(jīng)過(guò)熒光標(biāo)記，與陣列上的探針進(jìn)行雜交反應(yīng)，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，探針特異性地結(jié)合相應(yīng)被

8、熒光標(biāo)記的分子。用激光激發(fā)熒光標(biāo)記物，就可獲得樣品分子的信息，從而對(duì)基因序列及功能進(jìn)行大規(guī)模、高通量、平行地研究。DNA芯片技術(shù)為肝炎病毒診斷提供了一種快速、敏感、高通量、高效的方法，并可同時(shí)對(duì)多種肝炎病毒進(jìn)行大規(guī)模篩查和多種肝炎種類(lèi)的鑒定，芯片技術(shù)在病毒性肝炎診斷上的價(jià)值還在于，能對(duì)各種肝炎病毒的各亞型、變異株、耐藥性等情況，通過(guò)一張芯片同時(shí)診斷出來(lái)。應(yīng)用診斷芯片可為臨床上病毒性肝炎的診斷、用藥、療效判定及疾病的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸提供可

9、靠依據(jù)，具有非常大的發(fā)展前景。 論文全文共分為三部分： 1.肝炎病毒聯(lián)合診斷cDNA芯片的制備與應(yīng)用 對(duì)于基因組較小的HBV、HDV，利用普通PCR技術(shù)制備探針，采用PrimerPremier5.0軟件分別針對(duì)HBV、HDV保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異引物，得到各10條、4條探針；利用限制性顯示-PCR(RestrictionDisplay,RD-PCR)技術(shù)制備基因組較大且復(fù)雜的HCV芯片探針：首先運(yùn)用該技術(shù)建立了HCV三

10、個(gè)亞型的cDNA文庫(kù)，在分離RD產(chǎn)物條帶時(shí)，還用到了聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳結(jié)合銀染法。由pCV-H77C(HCV-1a)克隆共得到大小從222bp到840bp(含兩端共38bp長(zhǎng)的接頭，以下同)共22個(gè)限制性片段，由pCV-J4L6S(HCV-1b)得到216bp至907bp間片段共23個(gè)，由pJ6CF(HCV-2a)得到218bp至878bp間片段共21個(gè)；然后，從中選取了基因片段作為芯片探針。為了便于摸索實(shí)驗(yàn)條件和更好進(jìn)行探

11、針優(yōu)化，我們先后制備了3種芯片，包括HBV與HDV診斷芯片、HCV診斷芯片及HBV、HDV、HCV聯(lián)合診斷芯片。雜交結(jié)果顯示HBV、HDV診斷芯片、HCV優(yōu)化診斷芯片效果較為滿(mǎn)意。從以上芯片中選取探針制備了HBV、HDV、HCV聯(lián)合診斷芯片，對(duì)芯片的檢測(cè)質(zhì)量進(jìn)行了初步的評(píng)估：線性在104～1011copies/mL之間，芯片檢測(cè)法顯示了較好的線性(r分別為0.9902、0.9921、0.9819，P＜0.01)，其中稀釋最低濃度水平為H

12、BV0.92×104copies/mL、HDV1.08×104copies/mL、HCV1.03×104copies/mL，初步認(rèn)定該芯片三種肝炎病毒的檢測(cè)靈敏度不低于此水平；特異性：所制備的芯片檢測(cè)YFV、JEV、DV等其他病毒樣品結(jié)果均顯示為陰性，顯示有著較好的特異性；重復(fù)性：HBV、HDV、HCV的檢測(cè)重復(fù)性分別為：批內(nèi)精密度CV值為7.1％、7.2％、6.6％，批間精密度CV值為7.9％、8.2％、7.6％；準(zhǔn)確性：將共計(jì)HBV

13、、HDV14條PCR片段，HCV24條限制性片段，部分臨床陽(yáng)性血清(PCR產(chǎn)物)全部進(jìn)行序列測(cè)定，與GenBank進(jìn)行BLAST比較，結(jié)果表明克隆基因均屬于相應(yīng)基因，與理論一致。為了適應(yīng)臨床診斷的要求，能快速、敏感地檢測(cè)血清標(biāo)本，我們對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了一些優(yōu)化，包括減少雜交時(shí)間從常規(guī)的過(guò)夜雜交(16h)到2h，取消預(yù)雜交步驟，標(biāo)記的樣品不經(jīng)過(guò)純化，利用商用試劑盒對(duì)血清核酸進(jìn)行快速高效提取，將雜交時(shí)間從42℃提高到52℃等措施。通過(guò)這些改進(jìn)

14、，可以使病毒檢測(cè)在送檢標(biāo)本當(dāng)天出報(bào)告，敏感性也大大提高。 2.肝炎病毒診斷分型寡核苷酸芯片的制備與應(yīng)用 從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲取HBV全長(zhǎng)DNA序列，HDV及HCV4個(gè)基因型全長(zhǎng)cDNA序列，根據(jù)BLAST分析結(jié)果獲得HBV、HDV種屬保守序列及HCV各型特異性序列，以作為設(shè)計(jì)寡核苷酸(Oligo)探針的備選序列。用Arraydesigner3.0分別對(duì)BLAST檢索所得的HBV、HDV種屬保守序列和HCV型特異性序列

15、逐一進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)長(zhǎng)度均一的60meroligo探針。為了保證設(shè)計(jì)的探針具有高度的特異性和靈敏度，設(shè)計(jì)時(shí)使探針Tm值在80±5℃之間，GC含量介于40％～60％，且探針內(nèi)部和探針之間不易形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)。在BLAST比對(duì)中，與其它基因的同源性小于70％，連續(xù)相同堿基的數(shù)量不超過(guò)18個(gè)。遵循以上探針設(shè)計(jì)的原則，從HBV、HDV、HCV種屬保守序列和HCV型特異性序列中分別挑選出16、8、68條60meroligo探針。Oligo探針合成

16、和純化后，用芯片打印儀固定在玻片上。為便于研究，先后制備了2種芯片，包括HBV、HDV診斷芯片、HCV分型芯片。同cDNA芯片一樣，我們采用RD-PCR技術(shù)進(jìn)行樣品熒光標(biāo)記后與芯片雜交，并根據(jù)雜交結(jié)果篩除了有非特異雜交和信噪比低于4.0的探針，選取高特異的探針制備了HBV、HDV、HCV聯(lián)合診斷分型芯片。 3.利用寡核苷酸芯片對(duì)乙型肝炎基因表達(dá)譜的研究 本實(shí)驗(yàn)選用AgilentHumanlAoligo基因芯片進(jìn)行乙型肝炎

17、基因表達(dá)改變的研究，探討HBV感染的分子致病機(jī)理。對(duì)照細(xì)胞株HepG2，為分化較好的人肝癌細(xì)胞，所產(chǎn)生蛋白的功能與正常肝細(xì)胞近似；實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株HepG2.2.15，為HBVDNA轉(zhuǎn)染HepG2而成，可持續(xù)穩(wěn)定地分泌Dane顆粒及HBsAg、HBeAg、HBVDNA等。用Cy3標(biāo)記實(shí)驗(yàn)細(xì)胞HepG2.2.15，Cy5標(biāo)記對(duì)照細(xì)胞HepG2。通過(guò)雜交、掃描、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，根據(jù)PValueLogRatio值及gProcessedsignal/rP