乏氧對牙周膜細胞RANKL-OPG系統(tǒng)表達的影響.pdf

1、目的
　　 牙周病、糖尿病、心血管疾病和正畸治療等許多因素均可以導致人體局部組織的血液循環(huán)障礙。當牙周組織處于炎癥狀態(tài)下，局部微循環(huán)障礙，牙周組織乏氧明顯。組織乏氧以及炎癥細胞因子都可以活化核因子κb受體活化因子配基(receptoractivatorofNF-κBligand,RANKL)，它能與位于破骨細胞表面唯一的受體-核因子-κB受體活化因子(receptororactivatorofnuclearfactor-κB，R

2、ANK)相結合，通過一系列酶促級聯(lián)反應引起破骨細胞的活化和成熟。骨保護素(osteoprogeterin，OPG)為腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor,TNF)受體超家族成員，屬于一種溶性的糖蛋白，是RANKL的天然誘飼受體。OPG能競爭性地與RANKL結合，從而阻斷RANK與RANKL間的相互作用，抑制破骨細胞的活化和成熟。
　　 牙周病是一類侵犯牙齦和牙周支持組織的慢性炎癥性破壞性疾病，在乏氧微環(huán)境和局部炎

3、癥細胞因子的作用下，牙周組織周圍環(huán)境和牙周組織細胞代謝發(fā)生改變。在全身因素和局部因素的調控下，成骨細胞和破骨細胞作用失衡，骨吸收大于骨喪失。本實驗旨在體外乏氧環(huán)境下培養(yǎng)人牙周膜細胞，模擬相當于牙周膜組織局部缺氧的病理模型。探討不同氧張力對牙周膜細胞RANKL/OPG系統(tǒng)表達的影響，運用實時熒光定量PCR和酶聯(lián)免疫吸附法檢測牙周膜細胞在乏氧和常氧環(huán)境下RANKLmRNA和OPGmRNA及蛋白的表達。研究乏氧對牙周膜細胞生物學特性的影響，為

4、進一步研究乏氧對牙周病理變化及組織再生奠定理論基礎。
　　 方法
　　 人牙周膜細胞取自11～18歲兒童因正畸原因拔除的健康前磨牙，牙根已發(fā)育完成，刮取其根中1/3牙周膜組織，常規(guī)組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)。待細胞增殖達匯合點后行細胞傳代，取第5～7代細胞用于實驗。
　　 1.實驗分組
　　 乏氧組:牙周膜細胞分四組在1％O2、5％CO2、94％N2的37℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)6h、12h、24h和48h。對照組（常氧

5、組）:牙周膜細胞分四組在20％O2、5％CO2、75％N2的37℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)6h、12h、24h和48h。
　　 2.將牙周膜細胞以密度為1×106個/ml接種于六孔板中，按上述實驗分組分別移入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，Trizol兩步法分別提取細胞總RNA，反轉錄為cDNA，實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測RANKLmRNA和OPGmRNA的表達情況。
　　 3.將牙周膜細胞以密度為1×106個/ml接種于六孔板中，按上述實驗分

6、組移入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h、24h、48h，收集條件培養(yǎng)液，-80℃保存，酶聯(lián)免疫吸附法檢測OPG蛋白表達。
　　 結果
　　 1.乏氧組6h、12h、24h、48h組牙周膜細胞RANKLmRNA的表達明顯高于對照組，乏氧6h組與對照組相比差別不具有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，乏氧12h、24h、48h組與對照組相比RANKLmRNA的表達升高，且有時間依賴性，差別具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 2.乏氧6

7、h、12h、24h、48h組牙周膜細胞OPGmRNA的表達明顯低于對照組，隨乏氧時間延長，OPGmRNA的表達下降，差別具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 3.酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測乏氧條件下12h、24h、48h人牙周膜細胞培養(yǎng)液中OPG濃度明顯低于對照組，隨乏氧時間的延長OPG降低，差別具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 結論
　　 乏氧培養(yǎng)人牙周膜細胞RANKLmRNA表達升高，提示乏氧使牙周膜細胞R