肺炎嗜衣原體Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白的預(yù)測、篩選及免疫活性研究.pdf

1、目的：預(yù)測、篩選肺炎嗜衣原體（Chlamydophila pneumoniae，Cpn）III型分泌系統(tǒng)(Type III secretion system，T3SS)效應(yīng)蛋白編碼基因，并研究其免疫活性，探討預(yù)測的T3SS效應(yīng)蛋白重組蛋白在臨床Cpn血清學(xué)診斷中的應(yīng)用價值。
　　方法：①通過生物信息學(xué)分析結(jié)合相關(guān)文獻報道，預(yù)測Cpn T3SS效應(yīng)蛋白編碼基因；②以Cpn AR39菌株總RNA為模板，RT-PCR從轉(zhuǎn)錄水平分析Cpn

2、 T3SS效應(yīng)蛋白編碼基因在感染細胞的表達情況，并篩選出在感染后72小時有表達的基因；③PCR擴增預(yù)測Cpn T3SS效應(yīng)蛋白編碼基因，將其亞克隆至原核表達載體pGEX-6P-2中構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-6P-2/目的片段，經(jīng)PCR、測序鑒定后將其轉(zhuǎn)化至表達宿主菌 E.coli BL21中，IPTG誘導(dǎo)表達。采用SDS-PAGE和Western blot分析和鑒定表達產(chǎn)物；對溫度、IPTG和時間等誘導(dǎo)表達條件進行系列的優(yōu)化后，獲得可溶性表

3、達蛋白并大量誘導(dǎo)表達。GST純化樹脂純化重組蛋白，用tris8.0將目的蛋白透析降低谷胱甘肽濃度，BCA法測定蛋白濃度；用重組蛋白包被微孔板，建立間接ELISA法檢測臨床Cpn患者血清，評價重組蛋白的抗原性；用重組蛋白經(jīng)皮下注入免疫BALB/c小鼠，檢測免疫小鼠血清中重組蛋白多克隆抗體的效價，分析重組蛋白的免疫原性，并以制備的多克隆抗體為一抗，應(yīng)用間接免疫熒光檢測預(yù)測蛋白在感染細胞的定位情況，以篩選 Cpn分泌性蛋白。
　　結(jié)果：

4、通過生物信息學(xué)分析結(jié)合相關(guān)文獻報道，預(yù)測了14個Cpn T3SS效應(yīng)蛋白編碼基因：Cpn0704，Cpn0710，Cpn1022，Cpn0810，Cpn0962，Cpn0960， Cpn0422，Cpn0425，Cpn0323，Cpn0322，Cpn0432，Cpn0431，Cpn0434，Cpn0661。RT-PCR分析篩選了11個在感染后72h有表達的基因: Cpn0704，Cpn0710，Cpn1022，Cpn0810，Cpn09

5、62，Cpn0960，Cpn0422，Cpn0425，Cpn0323，Cpn0322， Cpn0431；PCR擴增得到其目的片段；構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng) PCR和測序鑒定證實插入片段為目的基因，測序結(jié)果與 Genbank上登錄序列完全一致；SDS-PAGE結(jié)果顯示，在IPTG誘導(dǎo)下，重組工程菌分別表達了相對分子量（Mr）與預(yù)測分子量相近的蛋白，對誘導(dǎo)表達條件進行系列的優(yōu)化后，獲得5個可溶性表達蛋白：Cpn1022，Cpn0960，Cpn081

6、0，Cpn0704，Cpn0425，經(jīng)GST純化樹脂純化后，純度在98％以上；以純化的重組蛋白為包被抗原建立間接ELISA法，檢測臨床Cpn患者血清，我們收集了20例確診為Cpn感染患者血清和10例正常人的血清進行ELISA分析，結(jié)果顯示:Cpn0810能識別全部病人的血清，Cpn0425能識別17個病人的血清，Cpn0960與Cpn0704能與14個病人的血清發(fā)生反應(yīng)，Cpn1022只識別11個病人的血清，而正常人的血清未出現(xiàn)上述反應(yīng)

7、。利用純化的Cpn1022， Cpn0960，Cpn0810，Cpn0704，Cpn0425重組蛋白免疫新 BALB/c小鼠，間接ELISA法測定兔免疫血清特異性抗體，效價分別為 Cpn0810與 Cpn0425達1:64000，Cpn0960與Cpn0704達1:32000，Cpn1022達1:16000；5種重組蛋白刺激 BALB/c小鼠，皮膚出現(xiàn)發(fā)熱、紅腫，6~10d后逐漸消失，遲發(fā)型超敏反應(yīng)（delayed type hyper

8、sensitivity，DTH）陽性。
　　結(jié)論：
　　1. Cpn0704，Cpn0710，Cpn1022，Cpn0810，Cpn0962，Cpn0960，Cpn0422，Cpn0425， Cpn0323，Cpn0322，Cpn0431在Cpn感染細胞后72h有轉(zhuǎn)錄；
　　2.成功構(gòu)建 pGEX-6P-2/Cpn0704，Cpn0710，Cpn1022，Cpn0810，Cpn0962， Cpn0960，Cpn0422

9、，Cpn0425，Cpn0323，Cpn0322，Cpn0431等11個原核表達載體，將其轉(zhuǎn)化至E.coli BL21后表達出相應(yīng)的重組蛋白；
　　3. Cpn1022，Cpn0960，Cpn0810，Cpn0704，Cpn0425重組蛋白具有良好的免疫原性，能刺激BALB/c小鼠產(chǎn)生高效價的特異性抗體；
　　4. Cpn1022，Cpn0960，Cpn0810，Cpn0704，Cpn0425重組蛋白具有較好的抗原性，能與C