乳酸乳球菌海藻酸鈣微囊應(yīng)用于胃腸道口服給藥的研究.pdf

1、乳酸菌是人和動(dòng)物腸道中的重要生理菌群之一，具有維持腸道內(nèi)菌群平衡，提高機(jī)體免疫力，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收等多種功能。一些乳酸菌屬還能代謝產(chǎn)生有機(jī)酸、雙乙酰、過(guò)氧化氫、細(xì)菌素等物質(zhì)，而這些物質(zhì)能夠抑制病原菌和腐敗菌，是微生態(tài)制劑具有特殊保健功能的原因之一。除具有益生菌功能外，乳酸菌還可作為宿主菌表達(dá)抗原或外源蛋白，作為疫苗載體刺激粘膜免疫應(yīng)答或作為功能性或治療性蛋白的傳遞載體。但目前，乳酸菌口服后在胃腸道中的活動(dòng)狀況，其作為疫苗載體刺激免疫應(yīng)答

2、的免疫機(jī)制等問(wèn)題還不清楚。要弄清楚乳酸菌進(jìn)入體內(nèi)后的狀態(tài)，最好的方法就是對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記然后跟蹤觀(guān)察。此外，無(wú)論是作為益生菌或是疫苗載體，乳酸菌到達(dá)腸道后均需要維持一定的活菌數(shù)才能發(fā)揮其作用，而口服需要經(jīng)過(guò)胃酸環(huán)境，將對(duì)其存活率有極大影響，因此如何提高乳酸菌經(jīng)胃酸環(huán)境后到達(dá)腸道的存活率是目前研究的一個(gè)熱點(diǎn)。 鑒于此，以乳酸菌中的典型菌屬——乳酸乳球菌為代表，制備其海藻酸鈣微囊，希望為其提供物理防護(hù)以抵抗胃腸道的惡劣環(huán)境。同時(shí)，我們?cè)?/p>

3、乳酸乳球菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)GFP，并以GFP表達(dá)為活菌標(biāo)記，檢測(cè)乳酸乳球菌經(jīng)口服后到達(dá)腸道的存活率，從而確定海藻酸鈣微囊包裹對(duì)乳酸乳球菌在胃腸道環(huán)境，特別是胃酸環(huán)境中的保護(hù)作用。 本文以乳酸乳球菌的NICE表達(dá)系統(tǒng)為基礎(chǔ)，選取該系統(tǒng)中的pNZ8150質(zhì)粒為表達(dá)載體，將gfp基因插入其特定位置，構(gòu)建GFP的重組表達(dá)載體。然后將該重組表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化至宿主菌NZ9700和NZ9000中，構(gòu)建GFP的組成型表達(dá)系統(tǒng)和誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)。通過(guò)熒光顯

4、微鏡觀(guān)察以及熒光分光光度計(jì)測(cè)量熒光值，表明兩種系統(tǒng)均成功表達(dá)GFP。其中，組成型表達(dá)菌株的GFP表達(dá)量較大，約為誘導(dǎo)型表達(dá)菌株的8倍，而且傳代10次后仍能穩(wěn)定表達(dá)。 根據(jù)上述結(jié)果，選取穩(wěn)定表達(dá)GFP且表達(dá)量較大的組成型表達(dá)菌株（NZ9700:pNZ8150-gfp）作為囊心物，制備其海藻酸鈣微囊制劑。并通過(guò)體外耐酸實(shí)驗(yàn)篩選最優(yōu)化微囊制備處方。將根據(jù)該優(yōu)化制備處方制備的NZ9700:pNZ8150-gfp海藻酸鈣微囊以及未包裹的N

5、Z9700:pNZ8150-gfp分別置于pH2.0酸性環(huán)境中進(jìn)行體外耐酸實(shí)驗(yàn)，一定時(shí)間后分別測(cè)量并比較兩者的存活率，從而確定該海藻酸鈣微囊對(duì)乳酸乳球菌在酸性環(huán)境中的保護(hù)作用。結(jié)果表明，酸處理30min，60min，90min，120min后，該海藻酸鈣微囊包裹分別使乳酸乳球菌的存活率提高了1370倍，525倍，235倍和105倍，說(shuō)明其對(duì)乳酸乳球菌在酸性環(huán)境中有顯著的保護(hù)作用。 顯微鏡下觀(guān)察，根據(jù)該處方所制備的微囊樣品呈較規(guī)則

6、球狀。采用粒徑粒形分析儀測(cè)樣品粒徑，結(jié)果顯示，所制備微囊樣品粒徑范圍為3~80μm，平均粒徑為22.91μm。 然后將上述海藻酸鈣微囊包裹的NZ9700:pNZ8150-gfp灌胃至小鼠體內(nèi)，以所表達(dá)的GFP為活菌標(biāo)記，確定到達(dá)小腸內(nèi)的活菌數(shù)，同時(shí)與未經(jīng)包裹的NZ9700:pNZ8150-gfp灌胃小鼠組，以及空白小鼠組進(jìn)行比較，確定海藻酸鈣微囊包裹對(duì)乳酸乳球菌在胃腸道環(huán)境中的保護(hù)作用。結(jié)果表明，以109CFU的活菌數(shù)灌胃，則灌

7、胃2h后，Microencapsulated Lactococcus lactis組小鼠小腸內(nèi)的活菌數(shù)約為3.2×108CFU，而Free Lactococcus lactis組小鼠小腸內(nèi)的活菌數(shù)約為3.4×106CFU，前者存活率約為后者的98倍，證明了海藻酸鈣包裹對(duì)乳酸乳球菌在胃腸道環(huán)境，特別是胃酸環(huán)境中確實(shí)有一定的保護(hù)作用。 通過(guò)以上研究，確定了對(duì)乳酸乳球菌在體外酸性環(huán)境中具有顯著的保護(hù)作用的海藻酸鈣微囊制備處方。根據(jù)該處