APR3蛋白的亞細(xì)胞學(xué)定位及其在細(xì)胞凋亡和自噬中的作用.pdf

1、目的：明確凋亡相關(guān)蛋白3（apoptosis related protein3，APR3）的亞細(xì)胞學(xué)定位，并探討其在細(xì)胞凋亡和自噬中的作用。
　　方法：采用生物信息學(xué)方法對(duì)APR3蛋白的信號(hào)肽、跨膜區(qū)、糖基化情況進(jìn)行預(yù)測(cè)，并采用Real-time PCR和Western blot檢測(cè)APR3在小鼠各器官組織及多種細(xì)胞株中的表達(dá)。利用Percoll法蔗糖密度梯度離心技術(shù)獲得小鼠肝臟組織溶酶體組份，并進(jìn)行Western blot分析，

2、檢測(cè)APR3蛋白與溶酶體膜標(biāo)記蛋白LAMP1在各亞細(xì)胞組份及溶酶體中的豐度；采用免疫熒光共聚焦方法探討 APR3與LAMP1或溶酶體示蹤劑Lyso-Tracker Red共同定位情況，以及構(gòu)建的APR3蛋白真核表達(dá)載體（pFUGW-APR3）表達(dá)的外源性APR3蛋白的亞細(xì)胞定位特征。APR3表達(dá)載體（pFUGW-APR3）和沉默載體（pLL3.7-APR3）轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，采用CCK-8和xCELLigence活細(xì)胞計(jì)數(shù)法、碘化丙

3、啶染色細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)等，檢測(cè)APR3對(duì)細(xì)胞增殖活力、細(xì)胞周期、細(xì)胞溶酶體膜通透性、溶酶體腔pH、溶酶體腔多種酸性水解酶活性（如組織蛋白酶、酸性磷酸酶、酸性脂酶和β-半乳糖苷酶等）等的影響；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，采用透射電鏡技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)的變化；采用Western blot法檢測(cè)APR3對(duì)凋亡相關(guān)蛋白BAX、BAD、BCL-2和cleaved caspase3表達(dá)的影響，以及自噬相關(guān)標(biāo)記蛋白Beclin1和Map1LC3B表達(dá)

4、的影響；利用小劑量Rapamycin刺激后，觀察APR3蛋白對(duì)phos-mTOR和p62蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示APR3是一個(gè)含有信號(hào)肽、單重跨膜的糖基化蛋白，Real-time PCR和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其在多種組織器官和細(xì)胞株中均有表達(dá)，其中在小鼠脾臟、腎臟、肝臟、肺、脂肪組織和部分腫瘤細(xì)胞株中具有相對(duì)較高的表達(dá)。對(duì)亞細(xì)胞器組份的Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)APR3蛋白與LAMP1蛋

5、白表達(dá)具有高度的重疊，免疫熒光雙染色結(jié)果也顯示APR3和LAMP1具有相同的細(xì)胞學(xué)定位特征，并且與溶酶體示蹤劑Lyso-Tracker Red具有相同的細(xì)胞器定位；NIH3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)染外源表達(dá)質(zhì)粒后免疫熒光染色顯示外源性 APR3與Lyso-Tracker Red具有相同的細(xì)胞器定位，并且出現(xiàn)部分定位失真現(xiàn)象，即在細(xì)胞膜中亦出現(xiàn)表達(dá)。NIH3T3細(xì)胞株中外源性APR3蛋白過表達(dá)降低細(xì)胞的增殖活力，細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯，阻滯于G1/S期，

6、同時(shí)伴細(xì)胞周期蛋白cyclin D1表達(dá)下降，細(xì)胞凋亡促進(jìn)因子BAX、BAD和cleaved caspase3表達(dá)升高，凋亡抑制因子BCL-2表達(dá)下調(diào)，自噬相關(guān)標(biāo)記蛋白Beclin-1和Map1LC3B表達(dá)增加；外源性APR3蛋白過表達(dá)還使細(xì)胞溶酶體膜通透性增加，溶酶體腔pH降低，溶酶體腔組織蛋白酶B、酸性磷酸酶、酸性脂酶和β-半乳糖苷酶活性增加；與此相反，APR3基因沉默則使溶酶體膜通透性顯著下降，溶酶體腔pH升高，但不影響溶酶體腔相