甲型血友病產(chǎn)前基因診斷的研究.pdf

1、目的:1978年Kan等應(yīng)用DNA重組技術(shù)開始對(duì)鐮狀紅細(xì)胞貧血進(jìn)行基因診斷，從此拉開了基因診斷的序幕，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速進(jìn)步，人類對(duì)基因組認(rèn)識(shí)的加深，基因診斷也有了蓬勃的發(fā)展，其方法不斷得到簡(jiǎn)化，準(zhǔn)確率也在提高?；蛟\斷分為直接診斷和間接診斷，間接診斷是以傳統(tǒng)的連鎖分析為主，依靠限制性長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)、短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)、數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)等多態(tài)性位點(diǎn)與致病突變位置的連鎖關(guān)系及其向后代的傳遞情況進(jìn)行診斷

2、，而直接診斷是直接檢測(cè)某一與疾病相關(guān)的基因是否存在異常，確定其致病基因的缺陷性質(zhì)，但仍然受到技術(shù)和經(jīng)濟(jì)方面限制因素的制約。 甲型血友病(hemophiliaA，HA)是一種遺傳性出血性疾病，由于FⅧ的遺傳性缺陷或缺乏所致，患者常常發(fā)生自發(fā)性或外傷后出血不止，出血可發(fā)生在任何部位，但以關(guān)節(jié)出血最為多見，反復(fù)多次關(guān)節(jié)出血可導(dǎo)致患者致殘，出血嚴(yán)重甚至可危及生命。目前患者主要輸注FⅧ制品或新鮮全血預(yù)防和治療出血，尚無(wú)有效的根治方法，給家

3、庭和社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)。FⅧ基因定位于Xq28，全長(zhǎng)186kb，包含26個(gè)外顯子及25個(gè)內(nèi)含子，是一個(gè)比較龐大的基因，其突變的異質(zhì)性非常豐富，使得該疾病的直接基因診斷難度較大，而22內(nèi)含子倒位是FⅧ基因上最為集中的一種突變，約占重型甲型血友病的一半，所以該突變的篩查具有重要的意義。開展HA的攜帶者檢測(cè)和產(chǎn)前診斷，可阻斷治病基因的傳遞，防止新的患兒出生，對(duì)于降低HA的發(fā)病率和提高人口素質(zhì)具有深遠(yuǎn)的意義。本研究應(yīng)用LD-PCR和I-PCR技

4、術(shù)進(jìn)行FⅧ基因22內(nèi)含子倒位的檢測(cè)，探討其應(yīng)用意義，并聯(lián)合傳統(tǒng)的連鎖分析來提高甲型血友病的基因診斷率尤其是產(chǎn)前基因診斷率，防止新的患兒出生，降低發(fā)病率，服務(wù)于臨床，從而減輕家庭和社會(huì)的負(fù)擔(dān)，且對(duì)于優(yōu)生優(yōu)育、提高人口素質(zhì)也有更為深遠(yuǎn)的意義。 實(shí)驗(yàn)材料與方法:31例甲型血友病患者，其中11可用于家系的連鎖分析；1例出生過已故患兒的孕婦；10例正常人作為對(duì)照。 本試驗(yàn)應(yīng)用飽和氯化鈉方法提取血液標(biāo)本DNA，煮沸法提取羊水DNA，

5、然后應(yīng)用LD-PCR、I-PCR方法進(jìn)行22內(nèi)含子倒位突變的基因診斷、攜帶者檢測(cè)及產(chǎn)前基因診斷，應(yīng)用PCR-DGGE方法對(duì)22內(nèi)含子倒位突變陰性的患者進(jìn)行14外顯子點(diǎn)突變篩查，最后以St14(DXS52)位點(diǎn)為VNTR多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行11個(gè)家系的連鎖分析以作出基因診斷和產(chǎn)前診斷。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:應(yīng)用LD-PCR、I-PCR的方法，我們從31例患者中檢測(cè)到7例存在22內(nèi)含子倒位的病人，并從4例患者母親中檢測(cè)到3例22內(nèi)含子倒位的攜帶者，而

6、且兩種方法獲得了一致的結(jié)論；應(yīng)用I-PCR的方法完成了1例22內(nèi)含子倒位攜帶者孕婦的產(chǎn)前診斷：其胎兒為正常女性，而不是倒位攜帶者。應(yīng)用連鎖分析的方法為11個(gè)甲型血友病家系進(jìn)行基因診斷和產(chǎn)前診斷，其中有8個(gè)家系在St14(DXS52)多態(tài)位點(diǎn)獲得信息，成功地為相關(guān)女性成員判斷出是否為攜帶者，為孕婦提供了產(chǎn)前診斷依據(jù)。 結(jié)論:1、國(guó)內(nèi)首次應(yīng)用I-PCR的方法進(jìn)行FⅧ基因22內(nèi)含子倒位的檢測(cè)，并完成了該突變的產(chǎn)前基因診斷。 2