馬傳染性貧血病毒EIAVYN的全基因組分析及囊膜蛋白免疫學(xué)特性分析.pdf

1、馬傳染性貧血病毒(EIAV，Equine infectious anemia virus)是馬屬動物傳染病-馬傳染性貧血(EIA，Equine infectious anemia)的病原，其與人免疫缺陷病毒(HIV-1/2)、猴免疫缺陷病毒(Simianimmunodeficiency virus，SIV)、牛免疫缺陷病毒(Bovine immunodeficiency virus，BIV)及貓免疫缺陷病毒(Feline immunod

2、eficiency virus，F(xiàn)IV)等同屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬成員。EIAV感染馬屬動物引發(fā)的馬傳染性貧血，嚴(yán)重危害馬屬動物健康，是世界范圍內(nèi)嚴(yán)格防控的馬屬動物疫病。
　　全面、詳細(xì)的流行病學(xué)數(shù)據(jù)，是有效執(zhí)行疫病防控的重要科學(xué)依據(jù)。但到目前為止，世界范圍內(nèi)僅有4株EIAV野外分離株的全基因組序列完成測定，他們分別是EIAVWYO(美國)、EIAVLIA(中國)、EIAVIRE(愛爾蘭)和EIAVMIY(日本)。有限的基因組信

3、息，限制了對全球EIAV進(jìn)化與流行規(guī)律的解析，需要完成更多現(xiàn)地分離毒株的基因序列測定，豐富EIAV的基因組信息。為此，本研究中，我們對保存于本實驗室的采自于中國云南的EIAV感染血清陽性騾脾臟淋巴結(jié)病料中的EIAV前病毒DNA，完成了全序列測定與基因遺傳變異分析。我們將該現(xiàn)地分離株命名為EIAVYN。經(jīng)序列測定與分析，我們發(fā)現(xiàn)與已公布全基因組序列的EIAV參考毒株相比較，EIAVYN表現(xiàn)出較低的基因組同源率，平均為80％左右。其與分離自

4、日本野馬體內(nèi)的EIAVMY的相似性最高，也僅為82.5％?；谌蚪M序列構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹分析顯示，該毒株已形成了相對獨立的分支，與參考毒株間均具有較遠(yuǎn)的遺傳距離。進(jìn)一步的Simplot分析，未發(fā)現(xiàn)該毒株基因組中重組有其他參考毒株的基因片段。同時，我們也通過聚類分析(alignment analysis)分別比較了EIAVYN與參考毒株在LTR、Gag、Pol和Env基因及預(yù)測的相應(yīng)氨基酸序列間的差異。相對于參考毒株，在主要結(jié)構(gòu)蛋白中，

5、EIAVYN Env變異水平最高（35％左右），而非結(jié)構(gòu)蛋白中，S2的突變水平最高。
　　基因突變會影響到病毒相應(yīng)的生物學(xué)功能。已有研究顯示，EIAV Env的變異，一方面表現(xiàn)出明顯的免疫逃逸特征，主要是逃逸宿主中和抗體的中和作用;另一方面也可能影響到宿主天然免疫限制因子Tetherin限制EIAV病毒復(fù)制的作用。為確定EIAVYN Env變異對其逃逸中和抗體和拮抗宿主限制因子作用的影響，我們開展了以下兩方面實驗。一方面，對于逃逸

6、中和抗體中和作用的能力，我們采用不同毒株的Env蛋白表達(dá)質(zhì)粒(pVR1012-3-8-Env、pVR1012-LN-Env、pVR1012-UK-Env、pVR1012-YN-Env)、Pony8.1及UKGP共轉(zhuǎn)293T細(xì)胞包裝假病毒，將假病毒與疫苗免疫馬（5＃、8＃）血清共孵育，之后感染穩(wěn)定表達(dá)EIAV病毒受體ELR1的293T細(xì)胞系。通過檢測細(xì)胞中熒光素酶活性，計算疫苗免疫馬血清中和50％假病毒感染的血清稀釋倍數(shù)。結(jié)果顯示，疫苗免

7、疫馬血清可50％中和各毒株感染的血清稀釋倍數(shù)從高到低依次是:pVR1012-3-8-Env＞pVR1012-LN-Env＞pVR1012-UK-Env＞ pVR1012-YN-Env。雖然疫苗血清仍然具有對EIAVYN毒株的中和作用，但相對于疫苗同源毒株，其仍表現(xiàn)出了對疫苗免疫馬血清中和作用的部分逃逸。免疫血清中和不同毒株的能力，與不同毒株囊膜的變異間具有相關(guān)性(5＃ R2=0.99，8＃ R2=0.96)。另一方面，對于EIAVYN

8、Env拮抗Tetherin分子限制病毒復(fù)制的作用，我們采用不同病毒囊膜蛋白表達(dá)質(zhì)粒、VR-GP2及pcDNA3.1-Eq-Tetherin共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，比較EIAVYN與各參考毒株Env與馬Tetherin分子間的相互作用差異。實驗結(jié)果顯示，Env對抗Tetherin限制作用的差異為:pVR1012--LN-Env＞pVR1012-UK-Env＞ pVR1012-3-8-Env＞pVR1012-YN-Env。EIAVYN拮抗Tet

9、herin作用較弱的原因，可能源于馬、騾二者Tetherin分子的遺傳差異及病毒對騾體內(nèi)長期復(fù)制的適應(yīng)。
　　綜上，本研究完成了一株EIAV現(xiàn)地分離株的全基因序列測定及分析，其相對于已公布全基因序列的EIAV毒株表現(xiàn)出高水平變異，該發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步豐富了EIAV現(xiàn)地毒株的基因多樣性水平。而通過揭示該毒株在逃逸免疫中和抗體和宿主天然免疫限制因子限制作用上的特點，促進(jìn)了對EIAV自身變異與逃逸宿主免疫控制間關(guān)聯(lián)性的研究，增進(jìn)了對EIAV免疫