豬瘟C株疫苗免疫前后CD4+T細胞αβTCR的多樣性及寡克隆化研究.pdf

1、T細胞受體（T cell receptor, TCR）是表達于T細胞表面的異二聚體復合物，是T細胞的重要表面標志，其中αβTCR識別由主要組織相容性復合物（major histocompatibility complex, MHC）分子遞呈的抗原肽。TCRα鏈和β鏈均有三個互補決定區(qū)（complementary determining regions, CDRs）–CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR3區(qū)與抗原肽識別和結合有關，不同

2、的CDR3序列代表不同的T細胞克隆，即一種CDR3序列就是一種T細胞克隆，因此通過監(jiān)測CDR3的譜型變化可以反映 T細胞的克隆性。目前，由于基因掃描-譜型分析技術具有快速、敏感和高效的特點，已作為腫瘤、病毒感染、自身免疫病及移植排斥反應中檢測T細胞TCR CDR3譜型變化的常規(guī)技術，現(xiàn)已成功揭示了機體免疫穩(wěn)定狀態(tài)下及臨床疾病狀態(tài)下αβTCR的變化規(guī)律，并將抗原特異的TCR基因用于免疫治療中，已取得了一定的成果。迄今為止，國內(nèi)外對豬T細胞

3、TCR在病原感染和疫苗免疫狀態(tài)下的研究很少，但豬的免疫學尤其是T細胞免疫機制的研究不僅有助于豬病防控，也有助于人類異體器官移植。因此，本研究主要利用基因譜型分析技術研究臨床健康豬T細胞αβTCR基因的多樣性及豬瘟C株疫苗免疫后CD4+ T細胞αβTCR的寡克隆性，為深入研究豬瘟病毒感染的細胞免疫機制以及豬瘟新型疫苗的研制提供技術和理論基礎。本研究取得的主要進展如下：
　　1.成功分析了臨床健康豬CD4+和CD8+T細胞TCRα鏈和

4、β鏈基因家族CDR3區(qū)譜型及長度多樣性。采用RT-PCR基因掃描分析技術從健康豬CD4+和CD8+T細胞中克隆了豬的19個TCR AV和20個TCR BV基因家族。譜型分析結果表明，19個TCR AV和20個TCR BV基因家族在兩類細胞亞群中均有表達，且每個家族的譜型均呈典型的高斯分布，多數(shù)家族含有八種以上不同長度的CDR3序列，相鄰CDR3序列間一般相差3 bp，表明健康狀態(tài)下T細胞受體 CDR3區(qū)具有長度和序列多樣性。此外，同一T

5、CR家族在兩種T細胞亞群的表達頻率不同，即使是同一細胞亞群，不同家族的表達水平也有差異。這種臨床健康豬CD4+和CD8+ T淋巴細胞αβTCR的多樣性有利于機體識別各種抗原肽，以維持免疫內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。
　　2.成功分析了豬瘟C株疫苗免疫后豬CD4+ T細胞αβTCR的變化規(guī)律。以豬瘟C株疫苗免疫4頭同窩合作小型豬，利用基因掃描–譜型分析技術分析免疫前后 CD4+ T細胞 TCR各家族CDR3區(qū)譜型變化。結果顯示，大多數(shù)譜型變化的家

6、族在免疫后第3天即抗體產(chǎn)生之前就出現(xiàn)克隆性擴增的變化，且這種克隆化趨勢達到高峰后逐漸減退，直至免疫后第15天TCR的譜型又恢復到了免疫前的高斯分布。＃884豬TCR AV14、AV38和TCR BV6S，#888豬TCR AV8-3S和TCR BV30，#892豬TCR AV5S、AV8-3S、AV8-4S、AV14和TCR BV4S、BV7S、BV15家族呈現(xiàn)單寡克隆化增殖趨勢。其中，TCR AV14在#884和#892豬，TCR A

7、V8-3S在#888和#892豬均呈克隆化表達，且TCR AV5S、AV38和TCR BV6S在豬瘟病毒C株感染的外周血單個核細胞中也有發(fā)現(xiàn)，表明PBMCs和CD4+T細胞可能對豬瘟病毒同一抗原肽產(chǎn)生了免疫應答。
　　3.成功分析了豬瘟C株疫苗免疫的呈克隆性擴增的CD4+T細胞TCR AV和BV家族CDR3的保守氨基酸基序。RT-PCR擴增上述TCR基因家族的CDR3區(qū)并進行克隆測序和生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)盡管同一基因家族CDR3序

8、列不完全相同，但其都含有保守的氨基酸序列。所有呈克隆性擴增的TCR AV家族CDR3區(qū)均含有“LX”基序，BV家族具有保守的“GGA”基序。這些保守的CDR3氨基酸基序可能與豬瘟病毒抗原肽識別和結合有關，這為豬瘟多肽疫苗的高通量篩選和開發(fā)奠定了基礎。
　　4.成功擴增了豬瘟病毒C株特異的TCR AV5S和TCR BV6S全長基因序列，在序列分析的基礎上構建了兩個真核表達質(zhì)粒并進行共轉(zhuǎn)染表達研究?；蛐蛄蟹治霰砻?，克隆的TCR AV