PDGFr-β抑制劑Ag-1295通過Erk通路促進MC3T3-E1細胞成骨分化.pdf

1、血小板源性生長因子受體(platelet-derived growth factors receptors PDGFRs)是存在于細胞膜表面的酪氨酸激酶，特異性應答血小板源性生長因子(platelet-derivedgrowth factors PDGFs)的一類受體。PDGFRs的結構特點是在胞外配位子結合區(qū)域有5個免疫球蛋白結構域，一個跨膜序列，胞內(nèi)有一個酪氨酸激酶結構域。二聚化的PDGFs結合到受體上并促使PDGFRs形成二聚體，

2、胞質結構域內(nèi)的酪氨酸殘疾發(fā)生自身磷酸化，通路被激活。PDGFRs包括兩種形式，即PDGFR-α與PDGFR·β。PDGFRs可以激活下游三條主要通路:分裂素活化蛋白激酶(themitogen-activated protE1n kinase MAPK)/胞外信號調控激酶(extracellularsignal-regulated kinase Erk)通路,3磷脂酰肌醇激酶(the phosphatidylinositol3-kinas

3、e)/Akt通路，及磷脂酶C-Y(the phospholipase C-Y PLC-γ)通路。其中MAPK/Erk通路在成骨分化過程中發(fā)揮重要的作用。
　　 PDGFs/PDGFRs信號通路在成骨類細胞的很多功能中都發(fā)揮重要的調控作用，然而該通路對成骨細胞分化作用的影響一直存在爭議。很多研究資料支持PDGF-BB對骨的形成及重塑有積極作用，F(xiàn)ierro與他的同事也發(fā)現(xiàn)當PDGFRs活性受到抑制時，人類骨髓間充質細胞的成骨作用也

4、受到明顯抑制:然而還有一些研究卻表明PDGFs抑制成骨細胞分化，如體外實驗發(fā)現(xiàn)當藥理學抑制PDGFRs活性時可以提高細胞內(nèi)礦化基因的表達并促進基質礦化的發(fā)生。臨床資料也報道慢性髓細胞性白血病患者(chronicmyeloid leukemia CML)在長期服用PDGFRs抑制劑藥物時，體內(nèi)骨量增加。Tokunaga等人在小鼠間充質干細胞中敲除PDGFR-β基因后發(fā)現(xiàn)該細胞堿性磷酸酶活性明顯增高，礦化標記基因表達量也上升，提示該細胞的成

5、骨分化能力大大增強；然而最近一項使用AG-1296抑制PDGFR活性的研究結果卻顯示PDGFR信號通路對人類間充質干細胞的成骨分化過程幾乎不產(chǎn)生影響。綜上所述，目前PDGFR信號通路與成骨分化過程的關系還不明確，該通路調控成骨分化的機制更是知之甚少。
　　 在本研究中，我們首先采用酪氨酸磷酸化抑制劑AG-1295在MC3T3-E1細胞中特異性抑制PDGFR-β，通過測定細胞堿性磷酸酶活性、茜素紅染色檢測礦化結節(jié)及RT-PCR測定

6、礦化標記基因表達量的實驗來揭示PDGFR-p通路對MC3T3-E1細胞成骨分化的影響，其次又采用Western-blot的方法檢測PDGFR-p通路是否通過Erkl/2通路來調控成骨分化過程。
　　 第一章PDGFRs抑制劑AG-1295對MC3T3-E1礦化表型的影響
　　 目的:檢測PDGFR-p特異性抑制劑AG-1295對MC3T3-E1成骨分化的影響
　　 方法:用PDGFR-p特異性抑制劑AG-1295

7、作用于成骨誘導中的MC3T3-E1細胞，在指定的時間內(nèi)檢測細胞內(nèi)的堿性磷酸酶活性，茜素紅染色觀察礦化結節(jié)的形成情況，RT-PCR檢測礦化標記基因的表達情況。
　　 結果:酪氨酸磷酸化抑制劑AG-1295使得MC3T3-E1細胞在成骨分化前期堿性磷酸酶活性水平升高，后期促進基質礦化，并且大多數(shù)礦化標記基因的表達水平均上升。
　　 結論:PDGFRs抑制劑AG-1295增強MC3T3-E1礦化表型，即PDGFR-β通路與MC

8、3T3-E1細胞成骨分化負相關。
　　 第二章PDGFR-p-Erkl/2負調控MC3T3-E1細胞基質礦化
　　 目的:檢測PDGFR-p通路是否通過Erkl/2通路調控MC3T3-E1細胞基質礦化
　　 方法:收集誘導分化2天、10天的MC3T3-E1細胞，提取總蛋白，Western-blot檢測AG-1295對Erkl/2表達量及其磷酸化水平的影響。
　　 結果:AG-1295對Erkl/2表達量沒