胰腺癌差異表達(dá)microRNAs的鑒定及功能研究.pdf

1、microRNAs(miRNAs)是由21-25個(gè)核苷酸組成的非編碼RNA，它通過與靶基因的3’-UTR的配對(duì)，促進(jìn)mRNA的降解或抑制mRNA的翻譯從而抑制其靶基因的表達(dá)。近年來，其與各種疾病的關(guān)系，尤其是與腫瘤的關(guān)系的研究成為熱點(diǎn)。胰腺癌是臨床上治療困難的疾病，對(duì)人類的健康威脅極大，大量研究工作集中于胰腺癌的腫瘤編碼基因的篩查和功能的鑒定，關(guān)于miRNAs與此疾病的關(guān)系知之甚少，研究miRNAs在胰腺癌發(fā)病機(jī)制中的作用具有重要的意義

2、。
　　 本實(shí)驗(yàn)以臨床上胰腺癌組織標(biāo)本和國際上公認(rèn)的ATCC胰腺癌細(xì)胞系Panc-l/Mia PaCa-2為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，用miRNAs芯片篩查胰腺癌組織與正常胰腺組織中差異表達(dá)的miRNAs。設(shè)定閾值1.5倍，SAM軟件分析找到32個(gè)差異表達(dá)的miRNAs，與對(duì)照組比較，其中上調(diào)的有18個(gè)，下調(diào)的有14個(gè)。Northern Blotting實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了部分的芯片結(jié)果：挑選了5個(gè)miRNAs分子，其中4個(gè)與芯片結(jié)果完全一致，一個(gè)結(jié)果有

3、出入。
　　 依據(jù)K-RAS改變是胰腺癌中最典型的特征，并且是導(dǎo)致胰腺癌腫瘤惡性行為的一個(gè)關(guān)鍵因素，我們檢測了胰腺癌細(xì)胞系中K-RAS蛋白水平，有文獻(xiàn)報(bào)道K-RAS基因是let-7的一個(gè)靶基因，因此我們又檢測了胰腺癌細(xì)胞系中l(wèi)et-7 miRNA的水平，發(fā)現(xiàn)與K-RAS的蛋白表達(dá)水平成負(fù)向關(guān)系；接著我們用let-7 miRNA直接導(dǎo)入胰腺癌細(xì)胞系Panc-l，檢測到K-RAS的蛋白水平下降，而K-RAS的mRNA水平無明顯變化，

4、說明let-7的降低是胰腺癌中K-RAS蛋白升高的原因之一。
　　 我們又檢測了胰腺癌細(xì)胞系以及正常胰腺組織中miR-96的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其在正常胰腺組織比胰腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)下降。用質(zhì)粒為載體在Mia PaCa-2細(xì)胞中高表達(dá)miR-96，結(jié)果發(fā)現(xiàn)K—RAS的mRNA水平不變、而蛋白水平下降，腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為（增殖、克隆形成能力、遷移和侵襲能力）受到了明顯的抑制，同時(shí)腫瘤細(xì)胞凋亡增強(qiáng)；我們又檢測了RAS下游通路中的兩個(gè)

5、重要分子ERK和AKT的表達(dá)有顯著下降，它們的活化形式phospho-ERK和phospho-AKT也有不同程度的下降。生物信息學(xué)分析miR-96的前體序列發(fā)現(xiàn)，各物種間存在多個(gè)位點(diǎn)核苷酸的多態(tài)性，且位于前體的莖環(huán)結(jié)構(gòu)區(qū)，但是成熟體的序列十分保守（＞99％序列相同），小鼠的miR-96成熟體序列與人的序列完全一致，因此推測miR-96可能是進(jìn)化過程中保留下來的具有腫瘤抑制功能的重要分子。
　　 綜合前面的結(jié)果，我們得出在胰腺癌中