非洲豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及其衣殼蛋白P72的原核表達(dá).pdf

1、本論文由兩部分組成，一是非洲豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立；二是非洲豬瘟病毒衣殼蛋白P72在大腸桿菌中的表達(dá)。主要試驗(yàn)和結(jié)果如下： 1.為建立一種快速、準(zhǔn)確、特異的ASFV定量檢測(cè)方法，根據(jù)TaqMan探針熒光定量分析原理，借助計(jì)算機(jī)輔助，對(duì)ASFV基因序列進(jìn)行分析并利用Beacondisigner軟件對(duì)檢測(cè)引物和探針進(jìn)行了優(yōu)化篩選；利用pET-ASFVP72質(zhì)粒作為參比模板對(duì)PCR反應(yīng)的退火溫度、鎂離子、引物、探針濃

2、度等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化并對(duì)本方法的靈敏度、特異性、定量線性關(guān)系、精確度等進(jìn)行了評(píng)估，同時(shí)通過(guò)對(duì)田間樣品的檢測(cè)對(duì)本方法的檢測(cè)效果進(jìn)行檢驗(yàn)，建立了ASFV實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。經(jīng)優(yōu)化，熒光PCR反應(yīng)中退火溫度、Mg2+、探針和引物的最佳濃度分別為52℃、4.5mmo/L、500nmol/L和400nmol/L，最低檢出量為102個(gè)拷貝數(shù)的質(zhì)粒，特異性為100﹪，Ct值的CV小于5﹪。對(duì)送檢的15份豬肉樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果全為陰性。上述結(jié)果表

3、明，所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法能夠快速、準(zhǔn)確、特異、靈敏地對(duì)ASF病毒核酸進(jìn)行定量分析，從而為ASF的預(yù)防提供了一個(gè)更新、更為可靠的檢測(cè)方法。 2.利用PCR技術(shù)，從含非洲豬瘟病毒(ASFV)P72基因的克隆質(zhì)粒BBBBPr4中擴(kuò)增出1.94kb的P72基因。將P72基因和表達(dá)載體pET-30c(+)分別用限制性核酸內(nèi)切酶FhaⅠ/XHoⅠ和BamHⅠ/XHoⅠ進(jìn)行雙酶切，然后在T4DNA連接酶作用下，將P72基因定向克

4、隆至載體pET-30c(+)中相應(yīng)位點(diǎn)上，并轉(zhuǎn)化至宿主菌BL21(DE3)中，得到了重組菌株BL21(DE3)(pET-ASFVP72)。經(jīng)PCR鑒定，構(gòu)建的重組菌株中含有P72基因。重組菌株BL21(DE3)(pET-ASFVP72)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，其表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western-blotting分析，結(jié)果表明衣殼蛋白P72基因可以在受體菌中高效表達(dá)，達(dá)到了菌體總蛋白的34﹪，表達(dá)產(chǎn)物的分子量約為78kD，并能被ASF