全麻過程中腦內ERK1-2和PKC的活性變化及其可能作用.pdf

1、全身麻醉應用于臨床已有160多年的歷史，但全麻藥的作用機理迄今還不完全清楚。全麻藥物是如何引起機體意識喪失、遺忘、制動等全麻效應的？全麻藥物作用的中樞靶點是什么？仍是未解之謎。多年來，科學界從整體、細胞和分子等不同水平對此進行了不懈的探索。雖然這些研究還遠未闡明問題的實質，但已肯定的是：全麻藥物是通過作用于中樞神經系統(tǒng)而產生意識喪失、遺忘和制動等麻醉效應的。
　　細胞內信號轉導分子分布廣泛，反應迅速，調控著細胞的各項生理功能。細胞

2、外信號調節(jié)激酶（ERK1/2）是一種重要的細胞內信號調節(jié)分子，在神經系統(tǒng)中表達廣泛，當細胞受到外界刺激時其磷酸化（pERK1/2）水平會發(fā)生快速變化。本實驗室既往的研究發(fā)現，吸入全麻藥異氟醚和七氟醚可以引起小鼠腦內一些部位和核團的pERK1/2明顯增強或減弱，并且這種改變與動物的麻醉-清醒過程之間存在著高度的一致性，提示這些腦區(qū)內ERK1/2磷酸化與全麻的產生或效應之間可能有密切的關系。本研究的第一部分在前期觀察了吸入麻醉誘發(fā)腦內pER

3、K1/2變化的工作基礎上，進一步觀察了異丙酚、氯胺酮靜脈麻醉對腦內pERK1/2的影響，以圖發(fā)現與吸入和靜脈麻醉相關的腦內核團的共性和區(qū)別，籍以為篩查與全麻效應相關的腦內核團提供線索。在此基礎上，本研究的第二部分，我們選擇在三種藥物全麻時pERK1/2水平都明顯變化的核團——EW核和杏仁中央核，用免疫熒光雙標和腦內核團毀損方法，探討了這些核團在全身麻醉的產生和/或效應中有無作用，為尋找全麻藥中樞作用的可能靶位積累資料。蛋白激酶C（PKC

4、）是另一種重要的細胞內信號轉導分子，調節(jié)細胞內許多重要的生理功能。既往許多離體研究發(fā)現，PKC可能是全麻藥中樞作用的一種潛在靶分子，因而在本研究的第三部分，我們通過觀察PKC抑制劑白屈菜紅堿對小鼠七氟醚麻醉效應的影響，了解PKC在全身麻醉中的具體作用。SynapsinⅠ（突觸蛋白Ⅰ）是一種突觸囊泡相關蛋白，其多個位點受蛋白激酶磷酸化，通過磷酸化和去磷酸化調節(jié)神經遞質的釋放。那么，全麻藥是否通過調節(jié)synapsinⅠ的磷酸化從而調節(jié)神經遞

5、質的釋放呢？在本研究的第四部分，我們初步觀察了七氟醚麻醉對小鼠大腦感覺運動皮質區(qū)synapsinⅠ磷酸化的影響，以了解全麻藥對突觸傳遞的作用。
　　第一部分，靜脈全麻藥對小鼠腦內pERK1/2表達的影響
　　1.異丙酚、氯胺酮及七氟醚麻醉小鼠腦內pERK1/2表達變化的比較
　　60只成年雄性BALB/c小鼠,隨機分為未麻醉對照組和異丙酚、氯胺酮和七氟醚麻醉組。對照組吸入純氧5min后直接脫臼處死；異丙酚及氯胺酮麻醉組

6、分別腹腔注射異丙酚或氯胺酮100mg/kg后純氧吸入。七氟醚組以1MAC吸入30min后用高流量氧洗脫。分別于清醒狀態(tài)和麻醉5min、麻醉后清醒5min及麻醉后清醒1h脫臼處死，灌注固定后取腦切片，免疫組織化學染色，觀察并對比三種全麻藥在麻醉的不同時間點腦內pERK1/2表達水平的變化。
　　結果發(fā)現：三種全麻藥麻醉-清醒過程中，小鼠腦內pERK1/2陽性細胞變化部位大致相似。麻醉時ERK1/2磷酸化發(fā)生抑制的部位主要為海馬和廣泛

7、的皮質區(qū)域，對照組小鼠腦內一些pERK1/2陽性細胞分布較多的部位如感覺運動皮質、嗅周皮質、梨狀皮質、扣帶皮質等，陽性細胞數在異丙酚、氯胺酮和七氟醚麻醉5min后均較對照組明顯減少（P＜0.05）。清醒5min后，pERK1/2陽性細胞數均有所回升（與麻醉5min組相比，P＜0.05）；清醒1h后恢復到對照組水平（與清醒對照組比P＞0.05）。海馬pERK1/2陽性細胞數在三種藥物麻醉后均明顯減少，七氟醚組清醒5min后即恢復正常，但異

8、丙酚和氯胺酮組清醒1h仍未恢復。另一方面，ERK1/2磷酸化增強的主要是皮質下核團，對照組中一些pERK1/2無表達或低表達的皮質下核團如杏仁中央核、臂旁外側核、延髓腹外側網狀核、視上核和EW核在三種藥物麻醉5min后pERK1/2陽性細胞數均較對照組明顯升高（P＜0.01），清醒5min后明顯回落，清醒1h已恢復至對照組水平（與對照組比P＞0.05）。
　　此外，三種全麻藥物麻醉時腦內pERK1/2表達增強的皮質下核團不盡相同。

9、異丙酚麻醉時韁外側核（LHb）陽性細胞明顯增多，清醒后恢復，而氯胺酮和七氟醚無此變化；氯胺酮麻醉時丘腦室旁核的pERK1/2陽性細胞激活較異丙酚和七氟醚麻醉時更為明顯。另外更重要的是，兩種靜脈全麻藥異丙酚和氯胺酮麻醉時下丘腦腹內側核腹外側部（VMHvl）陽性細胞激活增多，而吸入全麻藥七氟醚麻醉時未見此種變化。
　　2.pERK1/2與GABA能神經元的關系
　　取對照組和異丙酚麻醉5min組小鼠全腦切片，每組三只小鼠，每只小

10、鼠取一套腦片。作pERK1/2與GABA能神經元標志物GAD67的免疫熒光雙標記。結果發(fā)現：對照組、異丙酚麻醉5min組皮質和海馬有很少pERK1/2和GAD67雙標陽性神經元，麻醉時皮質下pERK1/2陽性細胞數增多的各個腦區(qū)和核團未發(fā)現雙標陽性細胞。
　　第二部分，EW及杏仁中央核在全麻效應中的可能作用
　　1.pERK1/2與urocortin神經元的關系
　　分別取異丙酚、氯胺酮和七氟醚麻醉5min組小鼠中腦部

11、位切片，每組三只小鼠，片厚40μm，作pERK1/2和urocortin免疫熒光雙標記。
　　結果發(fā)現：在異丙酚、氯胺酮和七氟醚麻醉5min小鼠腦片上，中腦EW核內存在大量的pERK1/2和urocortin雙標陽性神經元，提示urocortin神經元可能參與麻醉效應。
　　2.毀損EW核或杏仁中央核對全麻效應的影響
　　雄性SD大鼠，體重280-300g，在立體定位儀上行EW核和杏仁中央核直流電毀損。術后5天分別接受

12、異丙酚、氯胺酮和七氟醚麻醉，測量動物翻正反射消失時間和翻正反射恢復時間。行為學測定結束后，動物灌注固定取腦，毀損部位切片HE染色。根據毀損情況分別進行EW和CeA核毀損成功和毀損失敗統(tǒng)計。另取12只大鼠不毀損核團，僅給予麻醉，作為空白對照。
　　結果發(fā)現：毀損杏仁中央核后，異丙酚和氯胺酮麻醉大鼠翻正反射的消失時間與毀損對照組相比無顯著性差異（P＞0.05）；與毀損對照組相比，杏仁中央核毀損大鼠翻正反射的恢復時間在異丙酚麻醉組縮短（

13、P<0.01），而氯胺酮組無統(tǒng)計學差異。毀損大鼠杏仁中央核對七氟醚麻醉大鼠的翻正反射消失時間和恢復時間均無明顯影響。
　　大鼠EW核毀損后異丙酚麻醉的翻正反射消失時間較毀損對照延長（P<0.01），而氯胺酮組無統(tǒng)計學差異；EW核毀損后大鼠翻正反射的恢復時間在氯胺酮麻醉組有所縮短（P<0.05），而異丙酚組無統(tǒng)計學差異。大鼠EW核毀損后七氟醚麻醉的翻正反射消失和恢復時間與毀損對照組相比均無統(tǒng)計學差異。
　　第三部分，蛋白激酶C

14、在七氟醚麻醉效應中的可能作用
　　75只雄性BALB/c小鼠，隨機分為對照組和白屈菜紅堿（CHE）2.5、5、10、20mg/kg組，每組15只。分別給予腹腔注射DMSO或CHE2.5～20mg/kg。腹腔注射后45min，每組取三只作皮層和海馬pPKCγ的Westernblotting檢測，其余動物測定七氟醚麻醉的翻正反射消失時間（LORR）和夾尾反射恢復時間。
　　結果：Westernblotting分析表明應用白屈菜紅

15、堿后小鼠大腦感覺運動皮質區(qū)域pPKCγ較對照組表達降低（P<0.01）。與對照組比較，腹腔注射白屈菜紅堿5mg/kg，10mg/kg和20mg/kg組七氟醚麻醉小鼠翻正反射消失時間（LORR）縮短（P<0.01），夾尾反射恢復時間延長（P<0.01）。
　　第四部分，七氟醚麻醉對小鼠腦內synapsinⅠ磷酸化的影響
　　20只雄性BALB/c小鼠隨機分為對照組和七氟醚麻醉30min組，每組10只。對照組直接脫臼處死。七氟醚

16、麻醉組小鼠吸入1MAC七氟醚30min后脫臼處死。動物處死后每組取4只作皮質和海馬磷酸化synapsinⅠ（pSYNⅠ）的westernblotting分析，另6只灌注取腦，作大腦皮質部位pSYNⅠ的免疫組織化學分析。
　　免疫組化結果顯示：與對照組相比，七氟醚麻醉后小鼠大腦皮質區(qū)域pSYNⅠ陽性神經纖維表達量降低，具有顯著性差異（P<0.01），Westernblotting結果表明七氟醚麻醉小鼠感覺運動皮質pSYNⅠ/Acti

17、n的光密度比值與對照組相比也有下降的趨勢，但無顯著性差異（P>0.05）。
　　結論：
　　1.異丙酚、氯胺酮與七氟醚麻醉下小鼠腦內pERK1/2陽性細胞變化部位大致相似。ERK磷酸化發(fā)生抑制的部位主要為海馬和廣泛的皮質區(qū)域包括感覺運動皮質、梨狀皮質、扣帶皮質和嗅周皮質等，可能與麻醉引起記憶與感覺認知缺失有關。而ERK磷酸化增強的主要是皮質下核團如杏仁中央核、下丘腦室旁核、視上核和EW核等。但不同全麻藥引起皮質下pERK1/

18、2增強的部位不盡相同，特別是下丘腦腹內側核的腹外側部只在異丙酚、氯胺酮靜脈麻醉時被激活。這些核團在全身麻醉中具體起什么作用值得進一步研究。
　　2.在對照和異丙酚麻醉的小鼠腦片上，極少發(fā)現pERK1/2和GAD67雙重標記神經元。因此認為全麻下pERK1/2表達增強或者減弱的神經元并不是直接激活GABA能神經元。
　　3.在異丙酚、氯胺酮和七氟醚麻醉小鼠中腦EW核內存在大量的pERK1/2和urocortin雙標陽性神經元。

19、表明全麻時EW核pERK1/2表達增強與應激反應調節(jié)有關。
　　4.毀損SD大鼠的杏仁中央核或EW核后，異丙酚、氯胺酮和七氟醚麻醉大鼠的翻正反射消失時間和翻正反射恢復時間并沒有發(fā)生顯著的改變，說明這兩個部位在全麻意識消失的產生機制中不起關鍵作用。
　　5.使用PKC抑制劑白屈菜紅堿后，七氟醚麻醉小鼠翻正反射消失時間縮短，夾尾反射恢復時間延長，并且在一定范圍內隨劑量增大效應更加明顯。提示在整體動物上抑制PKC活性可以增強全麻效