豬腸外致病性大腸桿菌ompX基因缺失株構建及生物學特性研究.pdf

1、腸外致病性大腸桿菌（Extraintestinal Pathogenic E.coli，ExPEC），是一種重要的人畜共患病病原菌，主要通過其特有的毒力因子侵襲定植到人和動物腸道外組織引起疾病。近年來，本實驗室從臨床中分離到大量豬源性ExPEC，多表現為多重耐藥的特性，使得抗生素的治療效果大大降低，而且由于ExPEC的致病機制尚未闡明，也缺乏有效的疫苗加以控制，給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的威脅。另外，豬源ExPEC特定的毒力因子、種群、血清型與人

2、ExPEC相似，具有潛在的人類感染風險。為有效控制豬源ExPEC的感染，篩選有效的免疫保護性抗原，研發(fā)有效的疫苗，具有重要的意義。
　　OmpX是一種重要的細菌外膜蛋白，屬于Ail蛋白家族。該蛋白在其他細菌中參與細菌對細胞的黏附和侵襲，對抗宿主的免疫防御等，且與細菌的毒力有密切關系。因此，被認為有可能作為疫苗開發(fā)的候選靶標。
　　本試驗以豬源ExPEC PCN042為野生株，通過同源重組構建ompX基因缺失株及其回復補償株，

3、研究其生物學特性，探討OmpX在ExPEC多重耐藥性、生物被膜和致病性中的作用。主要研究結果如下:
　　1.ompX基因缺失株及回補株的構建
　　從野生株PCN042基因組擴增ompX基因的上下游同源臂，通過重疊PCR進行連接再與pRE112連接，構建重組轉移質粒pRE112△ompX。以含有重組質粒pRE112△ompX的x7213為供體菌，野生株為受體菌進行雙親本結合轉移，利用質粒上的雙向篩選標記篩選ompX基因缺失株△

4、ompX。
　　從野生株PCN042基因組中擴增ompX全長基因，連入穿梭載體pHSG396，構建重組表達質粒pHSG396-ompX,電轉化到△ompX缺失株，構建回補株Cm△ompX。
　　2.ompX基因缺失株的生物學特性研究
　　經PCR鑒定，本試驗構建的ompX缺失株在體外連續(xù)傳代培養(yǎng)，10代內均可穩(wěn)定遺傳。通過測定試驗菌株的生長曲線，證實ompX基因缺失不影響ExPEC的生長速率。
　　通過半固體培養(yǎng)

5、條件對試驗菌株的運動性進行測定，結果表明，ompX基因缺失株運動能力顯著高于野生株;經微孔板法測定試驗菌株的生物被膜形成能力，結果表明野生株、缺失株和回補株之間無顯著差異。本試驗進一步測定了試驗菌株對5種抗菌藥物的最低抑菌濃度(MIC)，結果顯示ompX缺失株對四環(huán)素和頭孢噻肟的敏感性增加。
　　本試驗采用體內和體外實驗評價了OmpX對ExPEC毒力的影響。肺上皮細胞和巨噬細胞黏附侵襲實驗表明，ompX缺失后細菌對細胞的黏附和侵襲

6、能力均顯著下降，但對巨噬細胞內存活能力并無顯著影響。體內小鼠實驗結果顯示，缺失株的LD50為野生株的6.27倍，對缺失株進行補償后LD50恢復到野生株的60％，證實ompX基因缺失可降低ExPEC的毒力;細菌載量實驗結果表明，小鼠感染8h和24h后，缺失株在心、肝和脾的定植能力都顯著下降，而在肺和腎的定植能力分別在感染24h和8h時顯著低于野生株。因此，體內和體外實驗均表明OmpX對于ExPEC的致病性至關重要，可能成為進一步研究ExP