豬腸外致病性大腸桿菌ompX基因缺失株構(gòu)建及生物學(xué)特性研究.pdf_第1頁(yè)
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1、腸外致病性大腸桿菌(Extraintestinal Pathogenic E.coli,ExPEC),是一種重要的人畜共患病病原菌,主要通過(guò)其特有的毒力因子侵襲定植到人和動(dòng)物腸道外組織引起疾病。近年來(lái),本實(shí)驗(yàn)室從臨床中分離到大量豬源性ExPEC,多表現(xiàn)為多重耐藥的特性,使得抗生素的治療效果大大降低,而且由于ExPEC的致病機(jī)制尚未闡明,也缺乏有效的疫苗加以控制,給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的威脅。另外,豬源ExPEC特定的毒力因子、種群、血清型與人

2、ExPEC相似,具有潛在的人類(lèi)感染風(fēng)險(xiǎn)。為有效控制豬源ExPEC的感染,篩選有效的免疫保護(hù)性抗原,研發(fā)有效的疫苗,具有重要的意義。
  OmpX是一種重要的細(xì)菌外膜蛋白,屬于Ail蛋白家族。該蛋白在其他細(xì)菌中參與細(xì)菌對(duì)細(xì)胞的黏附和侵襲,對(duì)抗宿主的免疫防御等,且與細(xì)菌的毒力有密切關(guān)系。因此,被認(rèn)為有可能作為疫苗開(kāi)發(fā)的候選靶標(biāo)。
  本試驗(yàn)以豬源ExPEC PCN042為野生株,通過(guò)同源重組構(gòu)建ompX基因缺失株及其回復(fù)補(bǔ)償株,

3、研究其生物學(xué)特性,探討OmpX在ExPEC多重耐藥性、生物被膜和致病性中的作用。主要研究結(jié)果如下:
  1.ompX基因缺失株及回補(bǔ)株的構(gòu)建
  從野生株P(guān)CN042基因組擴(kuò)增ompX基因的上下游同源臂,通過(guò)重疊PCR進(jìn)行連接再與pRE112連接,構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pRE112△ompX。以含有重組質(zhì)粒pRE112△ompX的x7213為供體菌,野生株為受體菌進(jìn)行雙親本結(jié)合轉(zhuǎn)移,利用質(zhì)粒上的雙向篩選標(biāo)記篩選ompX基因缺失株△

4、ompX。
  從野生株P(guān)CN042基因組中擴(kuò)增ompX全長(zhǎng)基因,連入穿梭載體pHSG396,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pHSG396-ompX,電轉(zhuǎn)化到△ompX缺失株,構(gòu)建回補(bǔ)株Cm△ompX。
  2.ompX基因缺失株的生物學(xué)特性研究
  經(jīng)PCR鑒定,本試驗(yàn)構(gòu)建的ompX缺失株在體外連續(xù)傳代培養(yǎng),10代內(nèi)均可穩(wěn)定遺傳。通過(guò)測(cè)定試驗(yàn)菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn),證實(shí)ompX基因缺失不影響ExPEC的生長(zhǎng)速率。
  通過(guò)半固體培養(yǎng)

5、條件對(duì)試驗(yàn)菌株的運(yùn)動(dòng)性進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果表明,ompX基因缺失株運(yùn)動(dòng)能力顯著高于野生株;經(jīng)微孔板法測(cè)定試驗(yàn)菌株的生物被膜形成能力,結(jié)果表明野生株、缺失株和回補(bǔ)株之間無(wú)顯著差異。本試驗(yàn)進(jìn)一步測(cè)定了試驗(yàn)菌株對(duì)5種抗菌藥物的最低抑菌濃度(MIC),結(jié)果顯示ompX缺失株對(duì)四環(huán)素和頭孢噻肟的敏感性增加。
  本試驗(yàn)采用體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了OmpX對(duì)ExPEC毒力的影響。肺上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞黏附侵襲實(shí)驗(yàn)表明,ompX缺失后細(xì)菌對(duì)細(xì)胞的黏附和侵襲

6、能力均顯著下降,但對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)存活能力并無(wú)顯著影響。體內(nèi)小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,缺失株的LD50為野生株的6.27倍,對(duì)缺失株進(jìn)行補(bǔ)償后LD50恢復(fù)到野生株的60%,證實(shí)ompX基因缺失可降低ExPEC的毒力;細(xì)菌載量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,小鼠感染8h和24h后,缺失株在心、肝和脾的定植能力都顯著下降,而在肺和腎的定植能力分別在感染24h和8h時(shí)顯著低于野生株。因此,體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均表明OmpX對(duì)于ExPEC的致病性至關(guān)重要,可能成為進(jìn)一步研究ExP

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