Cre-loxp重組系統(tǒng)介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因絨山羊標(biāo)記基因刪除的研究.pdf

1、細(xì)胞核移植技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展為動(dòng)物新品種的培育提供了新的技術(shù)平臺(tái)。然而利用上述技術(shù)在轉(zhuǎn)入目的基因的過(guò)程中，為了便于篩選，同時(shí)也轉(zhuǎn)入了標(biāo)記基因，抗生素抗性基因和熒光標(biāo)記基因是常用的標(biāo)記基因。標(biāo)記基因的應(yīng)用引起了人們對(duì)其安全性方面的關(guān)注和擔(dān)憂。而本研究的目的在于應(yīng)用Cre/loxp重組系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)標(biāo)記基因的安全刪除。
　　本研究首先給帶有K14啟動(dòng)子的VEGF164基因兩端帶上兩個(gè)相同方向的loxp位點(diǎn)，之后與pDsReD2-1載體

2、連接，成功構(gòu)建了表達(dá)載體pDsReD2-1-K14-VEGF-LOXP。之后用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞，篩選出純度較高的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞克隆。獲得的細(xì)胞克隆一部分用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因克隆絨山羊胚胎，經(jīng)胚胎移植后獲得了轉(zhuǎn)基因的絨山羊，今后可以利用該轉(zhuǎn)基因絨山羊的體細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記基因的刪除研究。另一部分用帶有信號(hào)肽片段的重組Cre酶即HTNC酶處理，用以檢測(cè)不同的處理時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞標(biāo)記基因刪除效果的影響。收集不同處理時(shí)間的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，并通過(guò)實(shí)時(shí)