家蠶絲氨酸蛋白酶BmSP82的研究.pdf

1、絲氨酸蛋白酶是一類(lèi)重要的水解酶，得名于Ser對(duì)底物的親核攻擊。絲氨酸蛋白酶作為蛋白酶家族的重要成員，其作用是斷裂大分子蛋白質(zhì)中的肽鍵，從而使大分子蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變成為小分子物質(zhì)。絲氨酸蛋白酶的催化作用是通過(guò)其活性中心的催化三聯(lián)體變化實(shí)現(xiàn)的，它們之中一定有一個(gè)是絲氨酸，故得名絲氨酸蛋白酶。絲氨酸蛋白酶在哺乳動(dòng)物體內(nèi)有著非常重要的功能，消化酶、凝血因子以及補(bǔ)體系統(tǒng)中的很多成員都屬于絲氨酸蛋白酶。由于絲氨酸蛋白酶在胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、組織重建、血管

2、形成和防止病原侵入等方面起著非常重要的作用，因此關(guān)于動(dòng)物絲氨酸蛋白酶的研究報(bào)道比較多。但是，有關(guān)昆蟲(chóng)絲氨酸蛋白酶的研究報(bào)道仍然還是比較少。Ross等人(2003)利用果蠅基因組數(shù)據(jù)，對(duì)果蠅中的絲氨酸蛋白酶基因家族進(jìn)行了鑒定，共獲得了119個(gè)基因。對(duì)該基因家族進(jìn)行進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)基因重復(fù)和變異在該家族的形成過(guò)程中具有非常重要的作用。
　　家蠶基因組中同樣有眾多的基因編碼絲氨酸蛋白酶。在家蠶不同的組織中，含有多種絲氨酸蛋白酶。趙萍等人依

3、據(jù)家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)，參照其他物種中絲氨酸蛋白酶基因的序列，全面分析并鑒定了家蠶中的絲氨酸蛋白酶基因。在家蠶基因組中總共鑒定到143個(gè)絲氨酸蛋白酶基因，比果蠅中的119個(gè)基因多了24個(gè)。并對(duì)這些基因進(jìn)行了系統(tǒng)的命名，分別記為:BmSP1～BmSP143。它們的分子量和等電點(diǎn)的分布比較廣泛。
　　氨基酸序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，家蠶中絲氨酸蛋白酶按活性位點(diǎn)的完整性可分為兩類(lèi):一類(lèi)是3個(gè)活性位點(diǎn)完整的SP類(lèi)，有51個(gè)絲氨酸蛋白酶基因，另

4、一類(lèi)則是活性位點(diǎn)不夠完整的SPH類(lèi)。家蠶絲氨酸蛋白酶的功能廣泛，已有功能研究報(bào)道的家蠶絲氨酸蛋白酶包括:繭酶、卵黃蛋白降解蛋白酶、中腸堿性蛋白酶和卵巢蛋白酶等，它們的功能涉及到卵的形成、胚胎發(fā)育、消化，甚至絲蛋白的形成等領(lǐng)域，表明絲氨酸蛋白酶在維持家蠶的正常生長(zhǎng)發(fā)育等生理活動(dòng)中是不可缺少的。
　　家蠶中的絲氨酸蛋白酶除了含有催化結(jié)構(gòu)域，還可能會(huì)含有其他的結(jié)構(gòu)域。例如，有的絲氨酸蛋白酶含有CUB結(jié)構(gòu)域。CUB結(jié)構(gòu)域是含有大約110個(gè)

5、氨基酸的胞外結(jié)構(gòu)域，因最初在三類(lèi)蛋白中被鑒定到而得名，它們分別是Complement subcomponents Clr/Cls，Uegf和Bonemorphogenic protein-1。含有CUB結(jié)構(gòu)域的蛋白有多種功能，它們都與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)。CUB結(jié)構(gòu)域通常與其他結(jié)構(gòu)域偶聯(lián)出現(xiàn)，其中包括絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域。很多包含CUB結(jié)構(gòu)域的蛋白含有復(fù)合CUB結(jié)構(gòu)域和復(fù)合蛋白酶結(jié)構(gòu)域。它們?cè)诩?xì)胞分化，生長(zhǎng)因子激活，降解多肽，細(xì)胞外生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程中

6、發(fā)揮著重要的生理功能。
　　家蠶是一種經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)，能夠分泌大量的絲纖維，在紡織工業(yè)中具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。絲腺作為家蠶唯一的泌絲器官，具有很高的研究?jī)r(jià)值，對(duì)家蠶絲腺吐絲機(jī)制的研究能夠有望提高蠶絲的產(chǎn)量和質(zhì)量，產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。本實(shí)驗(yàn)室在先前的研究中，通過(guò)對(duì)家蠶基因組芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)家蠶絲氨酸蛋白酶基因BmSP82是家蠶絲腺中表達(dá)量最高的一種絲氨酸蛋白酶，并且在家蠶的前部和中部絲腺特異高量表達(dá)。絲氨酸蛋白酶基因BmSP

7、82的功能研究有助于闡明絲氨酸蛋白酶在絲腺中具有的獨(dú)特功能，促進(jìn)我們對(duì)家蠶絲腺分泌絲蛋白的作用機(jī)制的理解，從而提高蠶絲的質(zhì)和量，為生產(chǎn)作出貢獻(xiàn)。
　　綜上所述，我們選取了BmSP82作為研究對(duì)象。首先，對(duì)BmSP82進(jìn)行了序列比對(duì)和信息分析，利用RT-PCR分析了其組織和時(shí)期表達(dá)特征。通過(guò)原核表達(dá)獲得了BmSP82成熟體的重組蛋白，通過(guò)注射小鼠進(jìn)一步制備了BmSP82的多克隆抗體，然后利用多克隆抗體檢測(cè)了BmSP82在家蠶體內(nèi)的存

8、在形式，利用BmSP82的CUB結(jié)構(gòu)域抗體進(jìn)行了組織定位;最后利用原核表達(dá)系統(tǒng)和酵母真核表達(dá)系統(tǒng)探究了BmSP82的酶活性。主要結(jié)果如下:
　　1、家蠶絲氨酸蛋白酶BmSP82的生物信息及表達(dá)特征分析;
　　BmSP82基因在SilkDB上的編號(hào)是BGIBMGA004445，基因定位于家蠶大造的第20號(hào)染色體上，具體位置為:nscaf2795:1108881..1115723(+strand)。芯片數(shù)據(jù)和RT-PCR結(jié)果表明

9、，BmSP82基因主要在家蠶的馬氏管和絲腺的前部和中部有表達(dá)。
　　結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果表明BmSP82基因編碼的絲氨酸蛋白酶是一個(gè)含有CUB結(jié)構(gòu)域和胰蛋白酶結(jié)構(gòu)域的絲氨酸蛋白酶。信息分析發(fā)現(xiàn)，它的前17個(gè)氨基酸為其信號(hào)肽序列，信號(hào)肽之后的N端含有一個(gè)由114個(gè)氨基酸殘基組成的CUB結(jié)構(gòu)域，CUB結(jié)構(gòu)域中含有8個(gè)半胱氨酸。C端含有一個(gè)胰蛋白酶類(lèi)結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域中含有完整的三個(gè)保守氨基酸殘基:組氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)和絲氨酸(S

10、er)，它們是絲氨酸蛋白酶的催化三聯(lián)體。胰蛋白酶結(jié)構(gòu)域中也含有8個(gè)半胱氨酸。兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間由18個(gè)氨基酸殘基連接，連接部分含有2個(gè)半胱氨酸，酶原激活位點(diǎn)為異亮氨酸((I))。
　　2、家蠶絲氨酸蛋白酶BmSP82的原核表達(dá)和抗體制備;
　　通過(guò)對(duì)BmSP82的序列分析，設(shè)計(jì)了表達(dá)引物，以家蠶5齡3天絲腺cDNA為模板進(jìn)行PCR，并將目的片段亞克隆到p28（pET28a改造）載體上，測(cè)序成功后轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株Transetta(

11、DE3)內(nèi)，表達(dá)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)BmSP82以包涵體形式表達(dá)。于是進(jìn)行切膠純化，將重組蛋白注入昆明鼠體內(nèi)，經(jīng)過(guò)30多天的飼養(yǎng)，得到了效價(jià)為1∶10000的多克隆抗體。
　　3、家蠶絲氨酸蛋白酶BmSP82的蛋白水平的時(shí)空表達(dá)分析;
　　利用制備的多克隆抗體，檢測(cè)到BmSP82在家蠶的絲腺和馬氏管中有表達(dá)。進(jìn)一步的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)BmSP82在家蠶的前部絲腺和中部絲腺中有表達(dá)，在后部絲腺中沒(méi)有表達(dá)。對(duì)絲氨酸蛋白酶BmSP82在家蠶中部絲腺前區(qū)

12、進(jìn)行了組織定位，發(fā)現(xiàn)其主要分布在家蠶中部絲腺前區(qū)的絲腺細(xì)胞層以及絲腺內(nèi)膜和絲腺腔的幾丁質(zhì)層之間，表明其可能參與了中部絲腺前區(qū)腔內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的形成，從而保護(hù)絲腺細(xì)胞免受吐絲過(guò)程中絲蛋白對(duì)絲腺腔內(nèi)側(cè)細(xì)胞的壓力和剪切力損傷。
　　4、家蠶絲氨酸蛋白酶BmSP82的表達(dá)及活性初探。
　　通過(guò)原核表達(dá)獲得了帶GST標(biāo)簽的BmSP82成熟體，利用GST標(biāo)簽進(jìn)行了親和層析，得到了純度較高的GST-BmSP82重組蛋白。利用TEV酶切除Bm