山羊卵巢microRNA.pdf

1、山羊(Capra hircus)是重要的經(jīng)濟(jì)動物之一,為人類提供毛、肉、皮等優(yōu)質(zhì)的農(nóng)產(chǎn)品,然而山羊繁殖力相對較低已成為制約山羊業(yè)快速發(fā)展的主要因素之一,所以人們一直致力于探索提高山羊繁殖力的育種新方法。卵巢是動物體內(nèi)重要的生殖器官之一,在生殖調(diào)控過程中發(fā)揮非常重要的作用。microRNA(miRNA)是一類重要的非編碼小RNA分子,其通過對靶基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控實(shí)現(xiàn)對卵巢功能的調(diào)節(jié)進(jìn)而影響機(jī)體生殖活動。然而山羊卵巢miRNA研究相對滯后,而

2、山羊卵巢miRNA的鑒定與功能研究將推動生殖調(diào)控分子機(jī)制及山羊分子育種的研究。
　　為進(jìn)一步揭示miRNA在山羊卵巢功能發(fā)揮及生殖調(diào)控過程中的作用,闡明生殖內(nèi)分泌遺傳調(diào)控機(jī)制,找到可用于山羊標(biāo)記輔助育種的分子標(biāo)記,本課題進(jìn)行了山羊卵巢miRNA的鑒定及生物學(xué)功能研究:(1)進(jìn)行了妊娠和非妊娠山羊卵巢小RNA高通量測序,揭示了卵巢小RNA分布及序列特征,從而為miRNA轉(zhuǎn)錄組及差異分析提供了數(shù)據(jù);(2)分析了妊娠和非妊娠山羊卵巢mi

3、RNA轉(zhuǎn)錄組特征,得到較為完整的miRNA表達(dá)譜及基因組信息,為功能和比較基因組學(xué)研究提供參考;(3)探明了妊娠和非妊娠山羊卵巢miRNA差異表達(dá)情況;(4)篩選了最優(yōu)的內(nèi)參基因,為目的基因的山羊組織表達(dá)相對定量分析提供了依據(jù);(5)q-PCR驗(yàn)證了測序結(jié)果,并在山羊卵巢和其他組織中檢測了目標(biāo)miRNA的表達(dá)譜;(6)對卵巢中高表達(dá)的miRNA進(jìn)行了靶基因預(yù)測和GO、Pathway功能分析,探討了目標(biāo)miRNA可能行使的生物學(xué)功能。

4、r>　　以上研究主要獲得如下結(jié)果:
　　(1)對妊娠和非妊娠山羊卵巢小RNA文庫進(jìn)行高通量測序,分別獲得9,977,224和11,209,532條的序列總數(shù),質(zhì)量處理后分別得到9,231,324和11,010,206條純凈序列,分別對應(yīng)377,973和204,342種不同的純凈序列;大部分序列長度位于20~24nt之間,其中長度為22nt(典型miRNA序列長度)的序列所占比例最大,在妊娠和非妊娠文庫中分別占到42.54％、56.

5、13%,說明測序結(jié)果富含潛在miRNA。
　　(2)構(gòu)建綿羊、豬、牛、馬和狗的已知miRNA數(shù)據(jù)庫、綿羊參考基因組數(shù)據(jù)庫、山羊無冗余EST數(shù)據(jù)庫,通過同源比對等生物信息學(xué)方法,得到了較完整的山羊卵巢miRNA表達(dá)譜及轉(zhuǎn)錄組特征信息:
　　妊娠和非妊娠文庫分別獲得535個(gè)和508個(gè)物種間保守的已知miRNA,共對應(yīng)617種miRNA,其中包含85個(gè)綿羊已知的miRNA;各文庫miRNA的表達(dá)主要集中在表達(dá)量前20位的miRNA

6、上(均占所有miRNA總表達(dá)量的80%以上),其中miR-143在妊娠山羊卵巢中表達(dá)量最高,let-7b在非妊娠山羊卵巢中表達(dá)量最高。
　　預(yù)測得到7個(gè)新的山羊miRNA。
　　得到兩文庫中表達(dá)量前10位的miRNA在綿羊染色體上的基因坐標(biāo),它們當(dāng)中有些miRNA只有一個(gè)基因坐標(biāo),有些則有兩個(gè)基因坐標(biāo),且得到4種miRNA兩兩組合為潛在的miRNA簇。序列分析結(jié)果表明,miRNA主要是以異構(gòu)體(isomiR)的形式存在,且部

7、分miRNA存在單堿基突變現(xiàn)象(mirSNP)。
　　以上轉(zhuǎn)錄組特征分析結(jié)果為進(jìn)一步研究miRNA在體內(nèi)的調(diào)控模式及比較基因組學(xué)提供了參考。
　　(3)對測序表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和差異比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)617個(gè)miRNA中有471個(gè)為兩文庫共表達(dá),90個(gè)為妊娠山羊卵巢特異表達(dá),56個(gè)為非妊娠山羊卵巢特異表達(dá);294個(gè)在妊娠文庫中上調(diào),113個(gè)在妊娠文庫中下調(diào);其中,非妊娠文庫中表達(dá)量前10位的miRNA在妊娠文庫中均下調(diào),而妊娠文庫

8、中表達(dá)量前10位的miRNA中,miR-143、miR-99a、miR-125b、miR-148a、miR-10b和miR-26a6個(gè)miRNA在非妊娠文庫中下調(diào),let-7a、let-7f、let-7c和let-7b4個(gè)miRNA在非妊娠文庫中上調(diào)。
　　(4)q-PCR分析了18S、TBP、HMBS、YWHAZ、ACTB、HPRT1、GAPDH和EEF1A2等8個(gè)候選內(nèi)參基因在山羊心、肝、脾、肺、腎、胃、子宮、卵巢、小腸和肌肉

9、等10種不同組織中的表達(dá)穩(wěn)定性。結(jié)果表明,18S為一般情況下最優(yōu)的內(nèi)參基因,但若試驗(yàn)精度要求較高,則需選擇18S和TBP二者組合或者18S、TBP和HMBS三者組合作為內(nèi)參。
　　(5)q-PCR驗(yàn)證了5個(gè)隨機(jī)選擇的miRNA在妊娠和非妊娠山羊卵巢中的表達(dá)量,且檢測了目標(biāo)miRNA在山羊9種組織中的表達(dá)譜。結(jié)果表明,q-PCR數(shù)據(jù)與測序數(shù)據(jù)基本一致,本次測序結(jié)果真實(shí)可靠,能夠反映妊娠和非妊娠山羊卵巢miRNA轉(zhuǎn)錄組;另外,miR-

10、143和let-7b在9種山羊組織均有表達(dá),且在山羊繁殖器官中(卵巢、輸卵管、子宮)表達(dá)量較高。
　　(6)利用PicTar和TargetScan軟件預(yù)測兩文庫表達(dá)量前10位miRNA的靶基因,并對靶基因進(jìn)行GO和Pathway分析。結(jié)果表明,目標(biāo)miRNA的靶基因在GnRH、Wnt、MAPK、TGF-beta、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂等生殖相關(guān)的細(xì)胞信號通路中顯著富集。此外,miR-143和let-7b的靶基因在細(xì)胞增殖與凋亡調(diào)節(jié)、核苷