水稻瘤矮病毒P3蛋白自身及P2蛋白與水稻PC1和PC3蛋白間的互作.pdf

1、由水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus, RGDV)引起的水稻瘤矮病分布于東南亞和東亞稻區(qū)，并局部流行，具有一定的經濟重要性。本文利用酵母雙雜交系統(tǒng)和雙分子熒光互補技術進行水稻瘤矮病毒的蛋白自身互作及其與水稻蛋白互作的研究。
　　 首先構建了P2、P3、P7、P8、Pn9、Pn10、Pn11、Pn12的酵母表達載體并進行自激活效應檢測；以水稻瘤矮病毒總RNA為模板，通過RT-PCR擴增獲得RGDVP2、P3、

2、P7、P8、Pn9、Pn10、Pn11、Pn12的基因序列，分別連接到酵母表達載體pGADT7和pGBKT7，構建陽性重組子pGAD-S2、pGAD-S3、pGAD-S7、pGAD-S8、pGAD-S9、pGAD-S11、pGAD-S12以及pGBK-S2、pGBK-S3、pGBK-S7、pGBK-S8、pGBK-S9、pGBK-S10、pGBK-S11、pGBK-S12。分別將陽性重組子轉化酵母AH109，并涂布于不同的營養(yǎng)缺陷型選擇

3、培養(yǎng)基平板，檢測RGDVP2、P3、P7、P8、Pn9、Pn10、Pn11、Pn12蛋白是否具有自激活活性。結果表明，各重組陽性質粒均不具有自激活活性，而RGDVPn10蛋白在酵母細胞中具有轉錄激活活性。
　　 其次，利用酵母雙雜交系統(tǒng)進行RGDVP3蛋白自身互作的研究。將陽性重組子pGAD-S3和pGBK-S3共轉化酵母AH109，并涂布于不同的營養(yǎng)缺陷型選擇培養(yǎng)基平板，檢測RGDVP3蛋白自身互作的情況。結果表明，RGDVP

4、3蛋白自身存在互作。用雙分子熒光互補技術在植物細胞內自然生理條件下對RGDVP3蛋白自身互作的情況做進一步驗證。以陽性的酵母表達質粒pGAD-S3為模板擴增，獲得S3基因，構建成重組雙分子熒光互補表達載體pSPYCE-HA-S3和pSPYNE-Myc-S3。然后將帶有HA標簽的pSPYCE-HA-S3和帶有c-Myc標簽的pSPYNE-Myc-S3的重組雙分子熒光表達載體分別轉化農桿菌GV1301后，處理農桿菌后混合注射煙草。切取注射部

5、位的煙草葉片組織于玻片上，在激光共聚焦顯微鏡(LeicaTCS STED, Germany)下觀察煙草表皮細胞中黃色熒光表達情況并拍照保存。雙分子熒光互補檢測的結果與酵母雙雜交的試驗結果一致：RGDVP3蛋白自身存在互作。
　　 再者，利用酵母雙雜交互補技術，以RGDVP2蛋白為誘餌篩選水稻cDNA文庫。將誘餌質粒RGDV pGBK-S2和水稻cDNA文庫質粒共轉化到酵母AH109中，轉化產物涂布于不同營養(yǎng)缺陷型選擇培養(yǎng)基，從而

6、篩選可能與誘餌蛋白P2互作的陽性克隆菌落。利用PCR鑒定陽性克隆中cDNA插入的片段大小，分別將含有不同大小插入片段的酵母質粒轉化大腸桿菌DH5α，經序列測定和B1ast比對，找到相關同源序列。根據同源序列相應的注釋信息，分析所篩選到的陽性克隆中所插入的基因片段大小、基因序列完整性以及讀碼框正確性等。結果表明，以RGDVP2蛋白為誘餌篩選水稻cDNA文庫最終獲得了2種陽性克隆，即為水稻PC1、PC3蛋白。根據數據庫中對應的同源基因的注釋

7、，并結合文獻資料對互作蛋白的研究，初步推測蛋白互作在RGDV病毒侵染、致病和寄主應答過程中可能產生的作用。
　　 最后，為了進一步驗證RGDVP2蛋白與水稻PC1、PC3蛋白之間的相互作用，提取水稻葉片總RNA后，通過RT-PCR擴增分別獲得水稻PC1、PC3全長ORF基因序列，將其分別連接酵母表達載體pGADT7，構建陽性重組子pGAD-PC1和pGAD-PC3。將誘餌質粒pGBK-S2分別與重組子pGAD-PCI和pGAD-

8、PC3共轉化酵母AH109，轉化產物涂布于不同營養(yǎng)缺陷型選擇培養(yǎng)基，檢測RGDVP2蛋白與水稻PC1、PC3蛋白之間的互作情況。結果表明，水稻PC1和PC3蛋白均能與RGDVP2蛋白發(fā)生互作。用雙分子熒光互補技術在植物細胞內自然生理條件下對RGDVP2蛋白與水稻PC1、PC3蛋白之間的互作的情況做進一步驗證。分別以陽性的酵母表達質粒pGBK-S2、pGAD-PC1和pGAD-PC3為模板擴增，獲得S2、PC1和PC3基因，構建成重組雙分

9、子熒光表達載體pSPYCE-HA-P2、pSPYNE-Myc-PCI和pSPYNE-Myc-PC3。然后將三個重組雙分子熒光表達載體分別轉化農桿菌GV1301后，處理農桿菌后以pSPYCE-HA-P2+pSPYNE-Myc-PCI和pSPYCE-HA-P2+pSPYNE-Myc-PC3組合注射煙草。切取注射部位的煙草葉片組織于玻片上，在激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS STED, Germany)下觀察煙草表皮細胞中黃色熒光表達情況

10、并拍照保存。結果表明，水稻PC3蛋白能與RGDVP2蛋白發(fā)生互作，跟酵母雙雜交試驗結果一致；而水稻PC1蛋白不能與RGDVP2蛋白發(fā)生互作，跟酵母雙雜交試驗結果不一致。
　　 綜上，本文構建了RGDVP2、P3、P7、P8、Pn9、Pn10、Pn11、Pn12的酵母雙雜交載體并進行自激活效應檢測；通過酵母雙雜交和雙分子熒光互補技術研究RGDVP3蛋白自身互作情況；利用酵母雙雜交互補技術，以RGDVP2蛋白為誘餌篩選水稻cDNA文