型雛鴨病毒性肝炎相關(guān)基因的篩選與驗證.pdf

1、我國是鴨養(yǎng)殖和消費大國，但是隨著養(yǎng)殖量的日益增加疾病也逐年增加并日趨復(fù)雜，尤其是育雛期飼養(yǎng)密度大且雛鴨的免疫功能尚未健全導(dǎo)致發(fā)病的機會增大，給水禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。Ⅰ型雛鴨肝炎主要侵染3周齡以內(nèi)的雛鴨，傳播迅速、發(fā)病急、傳染性強、致死率高，死亡率可達50-90％。病毒感染機體以后，機體可以通過多種信號傳導(dǎo)途徑引起病毒與機體細胞基因表達的變化。但到目前為止，Ⅰ型雛鴨肝炎可引起鴨體內(nèi)哪些基因表達的變化尚不清楚。因此尋找機體細胞中與病毒感染

2、復(fù)制密切相關(guān)的基因，不僅有助于闡明病毒感染致病的分子機制，而且有利于為鴨抗病育種尋求新的基因資源。本研究以3日齡全同胞公金定鴨為試驗材料，構(gòu)建DHV-I感染雛鴨和未感染雛鴨的組織消減cDNA文庫，以期從消減文庫中篩選和鑒定差異表達cDNA片段，從而鑒定鴨對DHV-I感染的應(yīng)答基因。具體結(jié)果如下:
　　 1、Ⅰ型雛鴨肝炎相關(guān)基因的篩選、鑒定和測序分析
　　 本試驗建立了0.4ml肌肉注射Ⅰ型雛鴨肝炎病毒（揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院彭

3、大新教授饋贈）感染模型。感染組在24-48小時內(nèi)集中死亡現(xiàn)象明顯，絕大部分雛鴨死亡之前出現(xiàn)精神狀態(tài)不佳，運動量減少，搖頭、點頭、背脖，全身痙攣性抽搐、兩腿伸直和角弓反張等典型癥狀。剖檢發(fā)現(xiàn)肝臟腫大，表面出現(xiàn)血點甚至血斑;腎臟充血、腫脹;脾臟腫大。以Ⅰ型雛鴨肝炎病毒RNA序列為基礎(chǔ)設(shè)計引物，通過RT-PCR法檢測DHV-I，感染組得到440bp的目的片段，對照組表現(xiàn)為陰性。
　　 抑制性消減雜交法成功篩選出全同胞金定鴨在人工感染D

4、HV-I與同期注射等量生理鹽水2種狀態(tài)下差異表達的ESTs，并通過同位素點膜雜交法進行鑒定。對信號值差異在2倍以上的PCR產(chǎn)物測序得ESTs序列，所得ESTs在NCBI中進行BLAST比對，擬定Evalue＜e-10，matchlength＞150bp，matchrate＞80％的基因為其同源基因。利用Uniprot數(shù)據(jù)庫，在線軟件GO、KEGG對篩選出的ESTs進行功能注釋和聚類分析。結(jié)果顯示:正、反向文庫各384個點雜交中分別篩選出

5、符合條件的陽性克隆222個、77個。299個陽性克隆均測序得299個差異表達的ESTs，299個ESTs對應(yīng)NCBI數(shù)據(jù)庫中70個差異表達的基因，包括SPEN、WSB1、HSP90等52個上調(diào)表達基因和ALB、TLR6、TLR7等18個下調(diào)表達基因。聚類分析得篩選出的ESTs，12％與DNA復(fù)制合成相關(guān)，12％參與脂肪酸代謝，48％與藥物、毒物、金屬離子和吡哆醛磷酸鹽等脅迫條件下異常生命調(diào)節(jié)活動相關(guān)，3％與蛋白質(zhì)螯合相關(guān)，另25％參與生

6、命體活動的其他調(diào)節(jié)作用。可以推測Ⅰ型雛鴨病毒性肝炎的發(fā)生和發(fā)展是多基因多步驟的復(fù)雜過程。差異基因在KEGG數(shù)據(jù)庫中涉及的通路眾多，多達69條。主要涉及代謝通路（Metabolicpathways，8條），內(nèi)吞通路(Endocyticpathways，6條)，局灶性粘連通路(Focaladhesion，4條)，溶酶體通路（Lysosome，4條），ECM受體通路(ECM-receptorinteraction，3條)，乙醛酸和二羧酸代謝(

7、Glyoxylateanddicarboxylatemetabolism，3條)，蛋白激酶信號通路（MAPKsignalingpathway，3條），細胞凋亡(Apoptosis，3條)和其他35條不同方面的通路。
　　 2、RT-PCR結(jié)合RACE法克隆ALB基因cDNA全長
　　 利用RT-PCR克隆篩選出的新基因(ALB基因)CDS區(qū)，同時利用RACE獲得ALB基因cDNA全序列，測序結(jié)果顯示:鴨ALB基因cDNA

8、全長為2107bp，包括47bp的5'UTR，212bp的3'UTR，1848bp的ORF，其mRNA主要在肝臟表達。鴨ALB基因共編碼615個氨基酸，比人、鼠、牛、豬和雞分別多出9、8、9、10和1個氨基酸殘基。氨基酸與雞的同源性最高(85.4％)，其次是鼠(47.2％)、人(46.6％)、牛(46.6％)和豬(45.8％)。ALB基因氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，鴨和雞聚為一類，親緣關(guān)系最近;哺乳動物聚為另一類。其蛋白同源模建結(jié)果顯示:

9、ALB蛋白主要以α螺旋為主(66.02％)，其次是隨機卷曲(25.37％)，延伸鏈(4.39％)和β轉(zhuǎn)角(4.23％)。
　　 3、RT-qPCR和ELISA法檢測部分差異表達基因
　　 利用RT-qPCR方法檢測篩選出的ALB、TLR7（下調(diào)基因），PSPH、WSB1（上調(diào)基因）mRNA在易感組、抗性組和對照組胸腺、肝、脾、肺、腎、大腦、小腦和腿肌中的表達量。結(jié)果表明:ALB基因在易感組和抗性組各組織中的表達量較對照組

10、均顯著下降(P＜0.01);抗性組與易感組相比小腦和腿肌ALB基因的表達量差異不顯著(P＞0.05)，其他組織中該基因的表達量均極顯著高于易感組(P＜0.01)。TLR7基因mRNA的表達規(guī)律與ALB相似。易感組各組織中PSPH和WSB1mRNA的表達量均極顯著高于對照組和易感組(P＜0.01);總體來看，抗性組的肝、脾、肺、腎等組織的表達量與對照組相比差異顯著或極顯著(P＜0.05或者P＜0.01)，而其余組織表達量差異不顯著(P＞0

11、.05)。ELISA法測定ALB蛋白在上述各組織中的表達量顯示:在肝，小腦和胸腺中，易感組中ALB蛋白的表達量極顯著或顯著低于對照組，高于抗病組(P＜0.05或者P＜0.01)。而在其他組織中，三處理組間差異不顯著(P＞0.05)。血液生化指標的測定結(jié)果表明:感染組中谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量較對照組極顯著升高(P＜0.01);尿素氮含量顯著升高(P＜0.05);血液葡萄糖、IgG含量與對照組相比有一定量的下降，但差異不顯著(P＞0.05);谷草轉(zhuǎn)