海洋貝類微衛(wèi)星分子標(biāo)記的開發(fā)和應(yīng)用【文獻(xiàn)綜述】

1、<p><b>　　畢業(yè)論文文獻(xiàn)綜述</b></p><p><b>　　生物工程</b></p><p>　　海洋貝類微衛(wèi)星分子標(biāo)記的開發(fā)和應(yīng)用</p><p>　　摘要：在海洋貝類育種中，常常缺乏對親本遺傳背景的了解以及對目標(biāo)性狀可靠準(zhǔn)確的早期的預(yù)選手段，造成了育種的盲目性大且效率低。微衛(wèi)星分子標(biāo)記具有多態(tài)性

2、豐富、雜合子比例較高、信息含量較大、具保守性和共顯性等特點(diǎn)，是最理想的分析重要經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳連鎖關(guān)系的標(biāo)記之一。本文就海洋貝類的微衛(wèi)星分子標(biāo)記的開發(fā)和應(yīng)用方面進(jìn)行了簡單的介紹。</p><p>　　關(guān)鍵詞：微衛(wèi)星分子標(biāo)記；原理；特點(diǎn)；研究進(jìn)展；應(yīng)用</p><p>　　上世紀(jì)80年代以來，DNA分子標(biāo)記的技術(shù)開始應(yīng)用在遺傳育種領(lǐng)域。在海洋貝類育種中，常常缺乏對親本遺傳背景的了解以及對目標(biāo)性

3、狀可靠準(zhǔn)確的早期的預(yù)選手段，造成了育種的盲目性大且效率低。而緊密連鎖的DNA標(biāo)記為實現(xiàn)水產(chǎn)動物目標(biāo)性狀的早期選擇提供了比較有效德途徑。因此，研究與海洋貝類重要經(jīng)濟(jì)性狀緊密連鎖的DNA標(biāo)記，特別是對缺乏遺傳連鎖圖譜的海洋貝類DNA標(biāo)記，就顯得十分重要。微衛(wèi)星分子標(biāo)記具有多態(tài)性豐富、雜合子比例較高、信息含量較大、具保守性和共顯性等特點(diǎn)，是最理想的分析重要經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳連鎖關(guān)系的標(biāo)記之一[1]。</p><p>　　1

4、 微衛(wèi)星分子標(biāo)記的原理</p><p>　　微衛(wèi)星DNA（Microsatellites DNA），又叫做短串聯(lián)重復(fù)序列（Short Tandem Repeats，STRs）或者簡單重復(fù)序列（Simple Sequence Repeats，SSRs），是由1~6個核苷酸作為核心序列[2]，首尾相互連接而形成的串聯(lián)重復(fù)序列，也是一種廣泛存在于真核生物基因組中的中度重復(fù)序列。</p><p>

5、　　微衛(wèi)星DNA在原核生物及真核生物基因組中廣泛存在，常見的有二、三、四核苷酸重復(fù)序列，約占真核生物基因組的5%。微衛(wèi)星DNA基本的構(gòu)成單位是2~6bp，其中位于編碼區(qū)附近的數(shù)量較多，也有位于內(nèi)含子、啟動子和Alu序列中的。微衛(wèi)星DNA的數(shù)目巨大，在人類基因組中就有約5×104~1×105個（CA）n重復(fù)序列，重復(fù)的次數(shù)一般為15至60次，重復(fù)的單位一樣，其長度一般小于200bp，但也有些長度較長的[3]。Beckm

6、ann和Weber等[4]許多科學(xué)家從微衛(wèi)星DNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)出發(fā)并結(jié)合PCR技術(shù)，從而建立起了以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，檢測相當(dāng)方便的微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)并獲得了廣泛的應(yīng)用。</p><p>　　在進(jìn)行微衛(wèi)星分子標(biāo)記時通常不會直接將微衛(wèi)星DNA作為探針，而是以互補(bǔ)于側(cè)翼序列的寡核苷酸作為引物，從而對DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。側(cè)翼序列可使微衛(wèi)星特異性地定位至基因組中的某一位置，從而使其具有特異性，而群體中微衛(wèi)星其本身核心部分的

7、堿基重復(fù)數(shù)目的不一致導(dǎo)致微衛(wèi)星位點(diǎn)呈現(xiàn)多態(tài)性。如果兩側(cè)側(cè)翼序列所包含的微衛(wèi)星的單位數(shù)目是相同的，那么這個個體在該微衛(wèi)星上是純合的，不然便是雜合的?；蛐偷呐袛鄤t是以某個微衛(wèi)星的側(cè)翼序列為特異性引物，由不同個體基因組的總DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再對其擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳并觀察有無特異性條帶。經(jīng)過對擴(kuò)增產(chǎn)物大小的比較，便可檢測出每一個個體在不同微衛(wèi)星座位上的遺傳結(jié)構(gòu)[5]。</p><p>　　微衛(wèi)星

8、標(biāo)記技術(shù)以其獨(dú)立的研究領(lǐng)域不斷地發(fā)展應(yīng)用，逐漸成為最具遺傳學(xué)家們重視的分子遺傳標(biāo)記技術(shù)，水生生物學(xué)家們也開始使用此技術(shù)對水生生物進(jìn)行更深入的研究[4]。</p><p>　　2 微衛(wèi)星分子標(biāo)記的特點(diǎn)</p><p>　　由于微衛(wèi)星廣泛分布于基因組中，具有密度大、多態(tài)性豐富、高度雜合且穩(wěn)定性好、遵循孟德爾分離定律共顯性遺傳、易于PCR擴(kuò)增等特點(diǎn)[6]，已成為最受學(xué)者們喜愛的一種分子生物學(xué)研究

9、方法。</p><p>　　2.1 豐富的多態(tài)性</p><p>　　與微衛(wèi)星多態(tài)性有關(guān)的統(tǒng)計量有3個，即全息交配率（PFIM）、雜合度（H）和多態(tài)信息含量（PIC）。微衛(wèi)星的信息含量比較大，具多態(tài)性（PIC≥0.7）且雜合子比例相對較高，因此應(yīng)用于基因定位連鎖分析時的效率也有所提高。Nei[7]等運(yùn)用微衛(wèi)星資料來估計遺傳距離，對于系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建的精確性在計算機(jī)上做了模型后觀察得到結(jié)論：微

10、衛(wèi)星的多態(tài)性高于血型、蛋白質(zhì)多態(tài)性，由其計算得到的基因雜合度通常在0.3～0.8之間，因此他們認(rèn)為，微衛(wèi)星運(yùn)用在遺傳距離估測，尤其在親緣關(guān)系相近的種群間以及繪制系統(tǒng)樹時，可以的到更為精確、效率更高的結(jié)果。微衛(wèi)星DNA標(biāo)記雖然往往只能探查單個座位，但由于其突變率非常低（在10-4～5×10-5之間），得以保證其在連鎖分析時保持高效性，是RFLP與RAPD所不及的。大多數(shù)RFLP呈現(xiàn)二態(tài)性，雜合率低（小于50%）并且信息含量也很低

11、，一般僅為0.2左右；而RAPD僅僅表現(xiàn)出顯性遺傳，不能夠直接區(qū)分開雜合子與純合子[5]。微衛(wèi)星DNA在基因組中的分布是隨機(jī)的，可在內(nèi)含子中存在，也可以出現(xiàn)于編碼區(qū)或者是染色體的其它區(qū)域內(nèi)。核心序列的重復(fù)次數(shù)可能在不同個體中是不同的，重復(fù)次數(shù)越多相</p><p>　　2.2 微衛(wèi)星標(biāo)記的穩(wěn)定性</p><p>　　某一物種的微衛(wèi)星引物可與相關(guān)密切的物種中，生物基因組中的微衛(wèi)星DNA所在的

12、區(qū)域是比較保守的。Yang和Movre等[7]先后用牛的微衛(wèi)星引物研究羊、馬和人的基因組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在羊中56%的引物可擴(kuò)增出特異性產(chǎn)物，其中有42%的擴(kuò)增產(chǎn)物呈現(xiàn)多態(tài)性，而馬和人的基因組中都沒有擴(kuò)增多態(tài)性。許多研究結(jié)果證明了可用牛的微衛(wèi)星標(biāo)記引物來構(gòu)建綿羊或山羊的遺傳基因圖譜，這就可以減少獲取微衛(wèi)星的工作量和加快基因組作圖的工作進(jìn)度。</p><p>　　2.3 微衛(wèi)星位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增</p>&l

13、t;p>　　微衛(wèi)星序列的等位基因在500bp以內(nèi)范圍的渡動是較理想的，而用于PCR及凝膠電泳分析所需的就是這些位點(diǎn)上的多態(tài)性，也正由于微衛(wèi)星位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增，使得它在實際應(yīng)用上相對除RAPD外的其它方法有更多優(yōu)勢，比如：減少樣品使用量、擴(kuò)大了樣品來源、引物的通用性等[7,9]。</p><p>　　微衛(wèi)星標(biāo)記作為一種新型的標(biāo)記方法，擁有許多的優(yōu)點(diǎn)，但也存在一些不足：在檢測微衛(wèi)星PCR擴(kuò)增產(chǎn)物過程中，在聚丙烯

14、酰胺膠上常常會出現(xiàn)“影子帶”（硝酸銀染色）和波峰重疊（熒光自動測序儀）現(xiàn)象[1]，增加了判讀等位基因的難度，使研究結(jié)果產(chǎn)生一定偏差，需要進(jìn)行更深入的研究以得到更精確的實驗結(jié)果。開發(fā)費(fèi)時、成本高：開發(fā)某種生物的微衛(wèi)星標(biāo)記是研究此種生物種群的先前條件。通過設(shè)計引物來檢測微衛(wèi)星的多態(tài)性，區(qū)域中的重復(fù)序列用PCR擴(kuò)增，引物的長度雖然很短，但需獲得特異性強(qiáng)、擴(kuò)增效率高的引物，微衛(wèi)星側(cè)翼區(qū)的堿基序列必須滿足若干條件。對于大部分動植物，由于缺乏DNA

15、信息的積累，需按照DNA抽提、文庫構(gòu)建、篩選、測序、引物設(shè)計的步驟開發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記。這個過程至少需要1至2個月，與RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA）和AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）標(biāo)記開發(fā)相比時間花費(fèi)得多。無效等位基因（null allele）的存在：無效等位基因是指不被PCR擴(kuò)增的等位基因，常常是由引物結(jié)合部位的點(diǎn)突變、插入或缺失引起。由

16、于微衛(wèi)星序</p><p>　　3 海洋貝類微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)</p><p>　　3.1 直接克隆獲得 </p><p>　　海洋貝類尤其是中國的很多養(yǎng)殖型海洋貝類在世界上是獨(dú)特的，只能由中國人自己來制備而這些種類的微衛(wèi)星標(biāo)記，其中主要的獲得途徑是隨機(jī)克隆法及磁珠富集法，磁珠富集法相對而言得到的微衛(wèi)星更多。直接克隆主要是克隆基因組DNA的微衛(wèi)星，最近也有從cDNA文

17、庫中篩選微衛(wèi)星陽性克隆，經(jīng)測序獲得含微衛(wèi)星的序列[10]。</p><p>　　3.2 從網(wǎng)上公布的序列中獲得</p><p>　　DNA和cDNA序列在網(wǎng)上都有公布，可能搜索到含微衛(wèi)星的序列。DNA的微衛(wèi)星序列可以利用軟件設(shè)計引物，直接克隆序列即可。目前網(wǎng)上公布的cDNA序列比DNA序列要多，就價值而言，從cDNA序列中得到的多態(tài)性標(biāo)記較高，但從cDNA制備微衛(wèi)星標(biāo)記有兩個不足之處：一是

18、在多態(tài)性上cDNA含有的微衛(wèi)星序列遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于DNA的[11]；此外，內(nèi)含子的存在使得cDNA序列所設(shè)計的引物有擴(kuò)增不出預(yù)期產(chǎn)物的可能。</p><p>　　3.3 物種間同源轉(zhuǎn)移法</p><p>　　由于物種之間DNA序列同源性的存在，微衛(wèi)星DNA的側(cè)翼序列保守性較好，可以將已開發(fā)的一種物種的微衛(wèi)星引物使用在其他物種上。一般認(rèn)為微衛(wèi)星引物在親緣關(guān)系相近的物種的通用性較好，Cui、Zhan和

19、Li等[2]用這種方法分別對櫛孔扇貝、海灣扇貝等進(jìn)行了嘗試，得到的結(jié)果也較理想。</p><p>　　4 微衛(wèi)星標(biāo)記在海洋貝類中的應(yīng)用及研究進(jìn)展</p><p>　　4.1 微衛(wèi)星標(biāo)記在海洋貝類中的應(yīng)用</p><p>　　在海洋生物中，微衛(wèi)星的研究已經(jīng)涉及到遺傳多樣性研究、遺傳連鎖圖的構(gòu)建、基因的定位與克隆、親權(quán)分析、品種鑒定、進(jìn)化分析及分子生態(tài)學(xué)研究等領(lǐng)域[12

20、]。</p><p>　　4.1.1 在遺傳多樣性上的研究應(yīng)用</p><p>　　海洋貝類遺傳多樣性及親緣關(guān)系的研究對種質(zhì)的搜集、保存以及在育種工作中的應(yīng)用具有相當(dāng)重要的意義，可以為海洋貝類的遺傳改良和基因資源的利用提供科學(xué)依據(jù)[2]。戰(zhàn)愛斌[12]利用9個多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記對選育體系中的基礎(chǔ)群體和選育群體的遺傳多樣性和遺傳分化分別進(jìn)行了評價，分析結(jié)果表明：基礎(chǔ)群體的遺傳多樣性豐富，得到群

21、體的平均觀測雜合度和平均期望雜合度分別為0.6007和0.7212。Sato等[5]利用了4個微衛(wèi)星標(biāo)記對分別取自日本北海道、本州和俄羅斯南Primorye的14個、3個和4個群體的766個個樣進(jìn)行了分析。發(fā)現(xiàn)所有群體的遺傳多樣性均較高，3個地理區(qū)域的遺傳分化比較明顯，通過對20年樣本的分析，表明群體遺傳結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生與養(yǎng)殖原因基本無關(guān)。</p><p>　　4.1.2 家系分析和遺傳連鎖圖譜構(gòu)建</p>

22、<p>　　生物體其基因功能的表達(dá)與調(diào)控都取決于基因組中所含堿基的排列順序和組成，基因圖譜的構(gòu)建不僅可以了解某個基因組的組織與結(jié)構(gòu)，還可以借助基因圖譜來鑒定和克隆對經(jīng)濟(jì)性狀產(chǎn)生影響的QTL，進(jìn)一步研究并操縱一些重要的基因[13]。近年來持續(xù)發(fā)展的分子遺傳學(xué)提供了較理想的DNA分子標(biāo)記來進(jìn)行遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建，如RFLP和小衛(wèi)星、微衛(wèi)星等。其中微衛(wèi)星因其高多態(tài)性、高雜合子比例和大含量的信息，還有保守性、共顯性等優(yōu)點(diǎn)，使得其引

23、物可以于不同實驗室之間進(jìn)行交流，適于自動化或半自動化操作，是目前制作遺傳連鎖圖譜的主要標(biāo)記之一[14]。</p><p>　　無效的等位基因和標(biāo)記的非孟德爾遺傳在雙殼類中普遍存在，Zhan等構(gòu)建了4個自交家系對于海灣扇貝19個EST-SSRs位點(diǎn)的遺傳方式進(jìn)行了分析。其中3個家系位點(diǎn)組合嚴(yán)重了偏離孟德爾遺傳，諾拋開無效等位形式的影響，則僅有1個位點(diǎn)不符合。在重新設(shè)計引物后，發(fā)現(xiàn)是引物序列包含單核苷酸突變引起無效等

24、位基因的[5]。因此，對海灣扇貝種群進(jìn)行研究或者親子鑒定之前，應(yīng)進(jìn)一步的分析所用的微衛(wèi)星標(biāo)記的無效等位形式。</p><p>　　4.1.3 物種鑒定</p><p>　　扇貝幼蟲的鑒定和區(qū)分是相當(dāng)困難的?；菝鬧15]利用由8個扇貝微衛(wèi)星組成一套組合，用來鑒定扇貝主要的4個養(yǎng)殖種類。這種方法受微衛(wèi)星標(biāo)記的物種特異性的影響很大，用此法能夠檢測出混合浮游的幼蟲中1%的個體，具有較好的準(zhǔn)確性和靈

25、敏性。</p><p>　　4.2微衛(wèi)星標(biāo)記的研究進(jìn)展</p><p>　　現(xiàn)階段DNA分子標(biāo)記的劃分方法有很多，其中有：①基于PCR反應(yīng)及不基于PCR反應(yīng)的劃分分法；②Ⅰ型標(biāo)記（與基因有連鎖關(guān)系的標(biāo)記）和Ⅱ型標(biāo)記(與基因沒有連鎖的標(biāo)記)劃分法；③顯性與共顯性劃分法，等等。共顯性和重復(fù)性、可比性高是微衛(wèi)星標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)，使其具有所獲長期資料的比對功能；另一個明顯的優(yōu)勢就是隨著工作的積累其應(yīng)用價

26、值會越來越大[4]。</p><p>　　隨著技術(shù)的成熟，加上有價值的序列豐富的資源，獲得微衛(wèi)星標(biāo)記在技術(shù)上和方法上都不再困難。除極少數(shù)創(chuàng)新性微衛(wèi)星克隆技術(shù)出現(xiàn)以外，微衛(wèi)星克隆的研究已不再是一個技術(shù)創(chuàng)新點(diǎn)，其重點(diǎn)將轉(zhuǎn)向以下幾方面[4]：①利用微衛(wèi)星序列鑒定出多態(tài)性高且擴(kuò)增效果好的標(biāo)記；②通過QTL定位來獲得微衛(wèi)星標(biāo)記與某個性狀之間緊密連鎖的關(guān)系，這樣的微衛(wèi)星標(biāo)記就升際為基因標(biāo)記（Gene marker），并成為Ⅰ

27、型標(biāo)記；③鑒定優(yōu)質(zhì)標(biāo)記的基礎(chǔ)上進(jìn)行應(yīng)用研究。在大力開發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記時，應(yīng)注意到Ⅰ型標(biāo)記與性狀相關(guān)基因連鎖在一起得可能性比一般的微衛(wèi)星標(biāo)記要大，同時SNP標(biāo)記能夠進(jìn)行全自動分析，由此使得從cDNA序列中或者直接從基因組DNA序列中開發(fā)出SNP標(biāo)記成為了當(dāng)前分子標(biāo)記領(lǐng)域研究的一大熱點(diǎn)。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 付春鵬,傅洪拓

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