紫草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)

1、紫草細(xì)胞培養(yǎng),,紫草及紫草寧,紫草（學(xué)名：Lithospermum erythrorhizon），別名山紫草、紫丹，是紫草科紫草屬植物，多年生草本，高達(dá)90厘米。多生長在山坡草地，目前尚未由人工引種栽培。,,紫草是一種重要的藥用植物，其根部富含紅色的萘醌類次生代謝產(chǎn)物-紫草寧及其衍生物。它們具抗、消炎、活血、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡和抑制1型HIV病毒等功效，同時(shí)也是一種天然的染料。紫草細(xì)胞中對羥基苯甲酸和焦磷酸香葉酯由羥基苯甲酸香葉基轉(zhuǎn)移酶催

2、化生成香葉基-對羥基苯甲酸，后經(jīng)一系列反應(yīng)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中形成紫草寧，并通過胞外分泌作用將形成的紫草寧微粒運(yùn)輸?shù)皆|(zhì)體外的細(xì)胞壁中。,紫草根,,,紫草素,紫草寧又稱紫草素，為赤褐色針狀晶體(由苯重結(jié)晶)天然色素，絳紅色?？咕?、抗炎、抗病毒、止血。用于化妝品生產(chǎn),現(xiàn)狀,紫草是我國傳統(tǒng)中藥材，多家中藥飲片廠以紫草為主要原料研制開發(fā)生產(chǎn)了約500多種（規(guī)格）中成藥、特藥、新型中藥，以及幾十種中藥飲片。這些產(chǎn)品投入市場后很受消費(fèi)者歡迎，銷量增加，對

3、紫草的需求量也隨之逐年大幅攀升。然而市場提供的紫草幾乎完全是野生品。由于大規(guī)模地濫采亂挖，已造成野生資源枯竭。那么，應(yīng)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)紫草素成為了解決問題的重要手段。,硬紫草組織培養(yǎng),前期研究表明,紫草細(xì)胞中紫草素的生物合成屬非生長偶聯(lián)型（產(chǎn)物只有在細(xì)胞生長停止時(shí)才能合成）,而且細(xì)胞生長和紫草素合成所使用的培養(yǎng)基也不同,因此采用二階段培養(yǎng)法。第一階段為愈傷組織繼代培養(yǎng)。B5基本培養(yǎng)基中添加吲哚乙酸(IAA)0.025mg/

4、L，6-芐基腺瞟呤(6一BA)1.Omg/L，光培養(yǎng)。光照時(shí)間6—8小時(shí)／天。第二階段為細(xì)胞懸浮培養(yǎng)形成紫草寧發(fā)其衍生物，M9基本培養(yǎng)基改加吲哚乙酸(IAA)0.1mg/L，6-芐基腺瞟呤(6-BA)1.Omg/L，Ca(NOa)2·4H2O 347mg/L，CuCl2·H2O 6.Omg/L。培養(yǎng)18天的愈傷組織按種到內(nèi)裝5Oml M9培養(yǎng)液的50ml三角瓶中，置于旋轉(zhuǎn)式搖床上培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速120r/min，振幅2

5、.5cm。懸浮細(xì)胞暗中培養(yǎng)20天收獲。,硬紫草懸浮培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞的生長曲線如圖-1所示，細(xì)胞數(shù)量隨著時(shí)間的變化曲線呈現(xiàn)S形。在細(xì)胞接種到培養(yǎng)基中最初的時(shí)間內(nèi)細(xì)胞很少分裂，經(jīng)歷一個(gè)延遲期后進(jìn)入對數(shù)生長期和細(xì)胞迅速增殖的直線生長期，接著是細(xì)胞增殖減慢的的減慢期和停止生長的靜止期。整個(gè)周期經(jīng)歷時(shí)間的長短植物種類和起培養(yǎng)細(xì)胞密度的不同而不同。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，一般在靜止期或靜止期前后進(jìn)行繼代培養(yǎng)，具體時(shí)間可根據(jù)靜止期細(xì)胞活力的變化而定。,圖-1

6、 懸浮培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞的生長曲線,,靜止期,減慢期,直線生長期,對數(shù)生長期,延滯期,由于懸浮培養(yǎng)具有：增加培養(yǎng)細(xì)胞與培養(yǎng)液的接觸面，改善營養(yǎng)供應(yīng)；可帶走培養(yǎng)物產(chǎn)生的有害代謝產(chǎn)物，避免有害代謝產(chǎn)物局部濃度過高等問題；保證氧的充分供給等三個(gè)基本優(yōu)點(diǎn)，使懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長條件比固體培養(yǎng)有很大的改善。,,接種后第三天左右，細(xì)胞團(tuán)邊緣變紅，表明紫草寧及其衍生物開始形成；細(xì)胞指數(shù)生長期，紫草寧及其衍生物的量穩(wěn)步上升；在靜止期，紫草寧及其衍生物形成速度加快

7、；培養(yǎng)細(xì)胞20天后紫草寧及其衍生物百分含量達(dá)到最高水平。20天后繼續(xù)培養(yǎng)，紫草寧及其衍生物量緩慢下降上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，紫草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)紫草寧及其衍生物的形成與細(xì)胞生長呈負(fù)相關(guān)，細(xì)胞生長緩慢則有利于目的產(chǎn)物的形成。其細(xì)胞生長與產(chǎn)物形成的動(dòng)態(tài)變化類型，是非生長偶聯(lián)型，因此硬紫草細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)應(yīng)采用成批培養(yǎng)或者固定化培養(yǎng)形式。,植物細(xì)胞培養(yǎng)和從完整的植物生產(chǎn)紫草寧的比較,固定化培養(yǎng),紫草細(xì)胞合成的色素主要存在于細(xì)胞內(nèi),同時(shí)有部分外泌到細(xì)胞

8、外,約占總量的30%,只有外泌的色素可以收集利用。為增加紫草色素外泌量,呂華等采用固定化培養(yǎng)法,以B5培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,固定化培養(yǎng)的細(xì)胞生長緩慢,第30天時(shí)的相對生長量為70%,僅為瓊脂培養(yǎng)基上生長的愈傷組織的1/6,但細(xì)胞能保持分裂達(dá)50天。色素產(chǎn)量達(dá)到4.2mg/gFW,相對色素外泌量達(dá)70%,而懸浮培養(yǎng)細(xì)胞僅有30%?？梢姽潭ɑ?xì)胞具有較強(qiáng)外泌能力。,,隨著細(xì)胞內(nèi)色素積累產(chǎn)生反饋抑制作用,不利于固定化培養(yǎng)的連續(xù)進(jìn)行。因此有必

9、要采用促進(jìn)產(chǎn)物釋放的技術(shù),研究表明:以正十六烷處理固定化細(xì)胞,可促進(jìn)產(chǎn)物釋放,連續(xù)培養(yǎng)的固定細(xì)胞保持其色素形成能力達(dá)80天之久,色素總產(chǎn)量達(dá)20mg/gFW,高于懸浮細(xì)胞。國內(nèi)也有學(xué)者報(bào)道在固定化或半連續(xù)培養(yǎng)中加入丙二醇也可增加紫草寧及其衍生物釋放到培養(yǎng)基中,但紫草懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中直接加入聚氨基甲酸乙酯泡沫能增加紫草寧及其衍生物得率,可達(dá)到95%以上。,紫草細(xì)胞合成紫草寧的影響因素,1.pH值對紫草細(xì)胞合成紫草寧的影響 方德秋等

10、人研究了pH值對新疆紫草懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長及紫草寧衍生物合成的影響。發(fā)現(xiàn)在pH=5.0-6.2范圍內(nèi)，新疆紫草細(xì)胞生長旺盛，尤以pH5.6為最。而且在一定的pH范圍內(nèi)，生產(chǎn)培養(yǎng)基的初始pH值對懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中紫草寧衍生物含量的影響不大。,,2 .激素對紫草細(xì)胞合成紫草寧的影響  細(xì)胞分裂素類對紫草寧衍生物的合成有抑制作用,且這種作用隨使用濃度的增加而加強(qiáng)，但是一定濃度的細(xì)胞分裂素對細(xì)胞的生長有促進(jìn)作用，因而有一個(gè)最適

11、添加量。NAA和IBA會(huì)明顯的抑制紫草寧的合成，低濃度的IAA既能促進(jìn)細(xì)胞生長又有利于紫草寧的合成。,,3. Ca2+/CaM對紫草細(xì)胞合成紫草寧的影響 研究發(fā)現(xiàn)Ca2+/CaM信號(hào)分子可能參與了對滇紫草細(xì)胞中紫草寧形成的調(diào)控，對紫草寧的產(chǎn)量有十分顯著的影響。合適的鈣源濃度能夠促進(jìn)紫草寧的生成。,,4 .添加前體物質(zhì)對紫草細(xì)胞合成紫草寧的影響  胡立勇研究了不同配方的培養(yǎng)基對紫草寧產(chǎn)量的影響，