USP4通過松弛素2介導(dǎo)的TGF-β1-Smad2-MMP-9路徑促進(jìn)乳腺癌侵襲遷移的機(jī)制研究.pdf

1、乳腺癌是中國女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，且發(fā)病率逐年上升，每年新發(fā)和死亡數(shù)量分別占全世界新發(fā)和死亡數(shù)的12.2%和9.6%，乳腺癌一旦發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，10年生存率不足10%。目前研究較熱的是乳腺癌的靶向治療，被認(rèn)為是將來最有前途的治療方式，而目前缺乏明確的靶點(diǎn)和有效藥物，因此尋找新的靶點(diǎn)進(jìn)而阻斷乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移是乳腺癌治療亟待解決的問題。研究顯示，乳腺癌的發(fā)生發(fā)展以及轉(zhuǎn)移是多種因素共同作用的結(jié)果，其中與蛋白質(zhì)降解紊亂密切相關(guān)。泛素-蛋白酶體

2、系統(tǒng)參與完成細(xì)胞內(nèi)絕大部分蛋白質(zhì)的降解，是非常重要的系統(tǒng)。許多研究表明，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在惡性腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用。
　　目的：作為去泛素化酶家族的主要類型，泛素特異性蛋白酶（Ubiquitin-Specific Protease, USP）與乳腺癌的發(fā)生以及晚期的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。多種USP在乳腺癌組織中已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)并且被證實(shí)呈高表達(dá)狀態(tài)，它們參與乳腺癌的增殖、轉(zhuǎn)移，以及與晚期乳腺癌不良預(yù)后呈正相關(guān)。USP4在多種腫瘤組

3、織中高表達(dá)并被稱為癌基因。目前ONCOMINE、Kaplan Meier-plotter數(shù)據(jù)庫是大家所公認(rèn)的公共數(shù)據(jù)庫，它整合了癌癥芯片數(shù)據(jù)庫并與網(wǎng)絡(luò)結(jié)合的數(shù)據(jù)平臺(tái)，包含已發(fā)表的各類文獻(xiàn)和TCGA等來源的RN A和DN A序列的數(shù)據(jù)其目的在于促進(jìn)發(fā)現(xiàn)全基因組表達(dá)分析。2個(gè)數(shù)據(jù)庫檢測(cè)了大約人類4800萬個(gè)基因，可對(duì)比最主要的癌癥類型和各自的正常組織的差異性表達(dá)分析，以及各種癌癥亞型分類和臨床及病理學(xué)的分析，能促進(jìn)發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物和治療靶

4、點(diǎn)。該數(shù)據(jù)庫對(duì)于研究某個(gè)基因在疾病中的作用具有重要參考價(jià)值。因?yàn)槿橄侔┑姆肿臃中湍壳芭R床上應(yīng)用較為廣泛，所以我們通過2個(gè)數(shù)據(jù)庫研究USP4基因在乳腺癌中的表達(dá)，及 USP4與分子分型的關(guān)系，從而可以指導(dǎo)乳腺癌患者的治療方案，預(yù)示了乳腺癌患者的預(yù)后。TGF-β/S mad信號(hào)通路的異常活化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，尤其在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。最新研究發(fā)現(xiàn)TGF-β受到泛素化修飾，影響該信號(hào)通路的活化，USP家族也參與TGF-β

5、信號(hào)通路的去泛素化修飾，其中USP4可通過調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子受體1（TβR1）去泛素化，增強(qiáng)TGF-β信號(hào)通路活性，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）和侵襲遷移。研究發(fā)現(xiàn)，USP4能夠提高SMAD2的磷酸化和 TGF-β基因的轉(zhuǎn)錄。但USP4如何調(diào)控TGF-β信號(hào)通路，如何調(diào)節(jié)乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制尚不清楚。松弛素近年來發(fā)現(xiàn)除了對(duì)生殖系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)的各種作用外

6、，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展的作用逐漸被發(fā)現(xiàn)。有研究發(fā)現(xiàn)實(shí)體腫瘤的細(xì)胞外基質(zhì)通過阻斷腫瘤外的藥物擴(kuò)散濃度影響治療的有效性，通過檢測(cè)在腫瘤內(nèi)的多肽激素松弛素的表達(dá)能夠提高細(xì)胞外基質(zhì)的降解和提高曲妥珠單抗治療的有效性。當(dāng)聯(lián)合松弛素進(jìn)行曲妥珠單抗治療后，能顯著抑制腫瘤生長。也有研究發(fā)現(xiàn)松弛素是 T GF-β1介導(dǎo)的胞外基質(zhì)合成和分泌的抑制物，跟成纖維細(xì)胞活化一樣起到作用。另外，它通過TGF-β1信號(hào)路徑介導(dǎo)MMP2、MMP-9降低了胞外基質(zhì)的分泌。還有

7、研究發(fā)現(xiàn)松弛素在乳腺癌患者血清中濃度水平增高，尤其是轉(zhuǎn)移患者松弛素水平升高更為顯著，與預(yù)后成負(fù)相關(guān)，其中松弛素2過度表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖存在正相關(guān)，與TGF-β、調(diào)控纖維化等都具有一定的關(guān)聯(lián)。因目前對(duì) USP4影響乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚沒有形成統(tǒng)一定論，所以我們深入研究USP4與松弛素及TGF-β1/S mad2/MMP-9路徑的關(guān)系，將為臨床乳腺癌患者的治療提供新的思路和希望。
　　方法：
　　1、通過ONCOMINE數(shù)據(jù)庫分

8、析USP4基因在乳腺癌組織及正常乳腺組織中的表達(dá)差異情況。通過Kaplan Meier-plotter網(wǎng)站分析USP4基因與乳腺癌患者5年和10年OS的差異。
　　2、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞、T47D細(xì)胞和正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A細(xì)胞中USP4的表達(dá)量。
　　3、通過s iRN A干擾技術(shù)建立靜默USP4基因的M DA-M B-231細(xì)胞；通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)建立過表達(dá)USP4基因的T4

9、7D細(xì)胞。然后分別利用RT-PCR和Western Blot方法檢測(cè)USP4的mRNA及蛋白表達(dá)情況。用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)及劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)靜默或過表達(dá)USP4基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞侵襲和遷移能力生物學(xué)行為的影響。然后分別檢測(cè)靜默USP4基因MDA-MB-231細(xì)胞和過表達(dá)USP4基因T47D細(xì)胞中MMP-9蛋白的表達(dá)，并在過表達(dá)USP4基因T47D細(xì)胞中加入MMP-9抑制劑BB94，通過Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)及劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其侵襲和遷

10、移生物學(xué)行為的能力的變化。
　　4、在過表達(dá)USP4基因T47D細(xì)胞中用siRNA技術(shù)分別導(dǎo)入SiRelaxin2、SiTGF-β1、SiSmad2，通過Western Blot檢測(cè)靜默了這三種基因后Relaxin2、TGF-β1、Smad2、MMP-9蛋白表達(dá)水平變化；通過Tra ns we ll侵襲實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分別靜默Re la xin2、TGF-β1、S mad2基因后對(duì)細(xì)胞侵襲遷移生物學(xué)行為的影響。
　　結(jié)果：

11、
　　1、通過包含全基因組的ONCOMINE數(shù)據(jù)庫分析顯示：USP4基因在乳腺癌組織中表達(dá)明顯高于正常乳腺組織中（P＜0.001）。通過Kaplan Meier-plotter網(wǎng)站分析USP4基因在HER-2陽性乳腺癌患者中5年OS差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.042），在其它分子分型的乳腺癌并沒有看出生存劣勢(shì)。
　　2、USP4在乳腺癌細(xì)胞MDA-M B-231細(xì)胞、T47D細(xì)胞中高表達(dá)，在乳腺正常上皮細(xì)胞MCF-10A細(xì)胞中

12、低表達(dá)，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3、通過RT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)能夠成功建立靜默USP4基因MDA-M B-231細(xì)胞。
　　4、劃痕實(shí)驗(yàn)顯示：靜默USP4基因MDA-MB-231細(xì)胞48 h后劃痕寬度顯著大于陰性對(duì)照組（P＜0.05）；侵襲實(shí)驗(yàn)顯示：靜默USP4基因M DA-MB-231細(xì)胞48 h后侵襲細(xì)胞數(shù)顯著少于陰性對(duì)照組（P＜0.05）。
　　5、通過RT-PCR和Wes

13、tern blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)能夠成功建立質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過表達(dá)USP4基因T47D細(xì)胞。劃痕實(shí)驗(yàn)顯示：過表達(dá)USP4基因T47 D細(xì)胞48 h后劃痕寬度顯著小于陰性對(duì)照組（P＜0.05），侵襲實(shí)驗(yàn)顯示：過表達(dá)USP4基因T47 D細(xì)胞24 h后侵襲細(xì)胞數(shù)顯著多于陰性對(duì)照組（P＜0.05）。
　　6、對(duì)過表達(dá)USP4基因的T47D細(xì)胞進(jìn)行Re la xin2、TGF-β1、S mad2、MMP-9蛋白的檢測(cè)，結(jié)果顯示：Re la xin2、T

14、GF-β1、Smad2、MMP-9蛋白表達(dá)明顯提高。對(duì)靜默USP4基因的MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行Relaxin2、TGF-β1、Smad2、MMP-9蛋白的檢測(cè)，結(jié)果顯示TGF-β1、Smad2、MMP-9蛋白表達(dá)均顯著下降。提示USP4的表達(dá)影響Re la xin2、TGF-β1、S mad2、MMP-9蛋白的表達(dá)。
　　7、我們利用 siRNA干擾技術(shù)對(duì)過表達(dá) USP4的 T47D細(xì)胞分別進(jìn)行 Smad2、TGF-β1基因

15、的靜默，然后用 Western blot實(shí)驗(yàn)對(duì)其分別進(jìn)行 Relaxin2、TGF-β1、Smad2、MMP-9蛋白的檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：阻斷S mad2基因后的過表達(dá)USP4的T47 D細(xì)胞，其 Smad2、MMP-9蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比明顯下調(diào)，卻沒有影響 Relaxin2蛋白的表達(dá)。阻斷TGF-β1基因后的過表達(dá)USP4的T47D細(xì)胞，其TGF-β1、Smad2、MMP-9蛋白的表達(dá)與對(duì)照組相比均明顯下調(diào)，也沒有影響Re la xin

16、2蛋白的表達(dá)。
　　8、我們通過siRNA干擾技術(shù)對(duì)過表達(dá)USP4的T47D細(xì)胞進(jìn)行Relaxin2基因的干擾，然后用Western blot實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：過表達(dá)USP4的T47D細(xì)胞靜默Re la xin2基因后，其TGF-β1、S mad2和MMP-9蛋白的表達(dá)與對(duì)照組相比都是顯著降低。
　　9、Western blot結(jié)果顯示：靜默USP4基因MDA-MB-231細(xì)胞中MMP-9蛋白表達(dá)較陰性對(duì)照組顯著降

17、低(P＜0.05)，而在USP4過表達(dá)的T47 D細(xì)胞中MMP-9蛋白表達(dá)較陰性對(duì)照組表達(dá)顯著增加(P＜0.05)。對(duì)過表達(dá) USP4的 T47 D細(xì)胞應(yīng)用MMP-9的抑制劑BB94進(jìn)行處理后劃痕試驗(yàn)結(jié)果顯示，BB94處理的 T47D細(xì)胞的劃痕寬度顯著大于未處理組（P＜0.05）。Tra nswe ll侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明BB94處理的過表達(dá) USP4基因 T47D細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著少于未處理組（P＜0.05），這提示USP4促進(jìn)乳腺

18、癌細(xì)胞的侵襲能力也能夠被MMP-9的抑制劑抑制，MMP-9在USP4促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移中發(fā)揮作用。
　　10、對(duì)USP4過表達(dá)的T47D細(xì)胞分別靜默Re la xin2、TGF-β1和S imad2基因后，進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示：SiRe la xin2組、S iTGF-β1組、S iS mad2組劃痕寬度與對(duì)照組相比均明顯增寬，遷移能力明顯下降（*P＜0.05），其中 S iRe la xin2組劃痕寬度最大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)

19、意義(**P＜0.01)。對(duì) USP4過表達(dá)的 T47D細(xì)胞分別靜默Relaxin2、TGF-β1和Simad2基因后，進(jìn)行Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示：SiRelaxin2組、SiTGF-β1組、SiS mad2組侵襲細(xì)胞數(shù)目與對(duì)照組相比均明顯減少，侵襲能力明顯下降（*P＜0.05），其中 S iRe la xin2組侵襲細(xì)胞數(shù)目最少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(**P＜0.01)
　　結(jié)論：
　　1. USP4能夠促進(jìn)乳

20、腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲；
　　2. MMP-9參與USP4影響乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移的過程；
　　3. USP4通過激活TGF-β1/Smad2信號(hào)通路促進(jìn)MMP-9的表達(dá)，USP4通過TGF-β1/S mad2/M MP-9信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲遷移；
　　4. USP4影響Re la xin2的表達(dá)，USP4通過Re la xin2介導(dǎo)的TGF-β1/S mad2/MMP-9信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌的侵襲遷移；