GSK-3β-FoxO1-C-EBP-δ軸在食管癌細(xì)胞中核心調(diào)控作用研究.pdf

1、目的：
　　分析食管鱗癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）中GSK-3β、FoxO1和C/EBP-δ表達(dá)特征，確定其異常表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性；檢測(cè)GSK-3β及FoxO1基因沉默后對(duì)ESCC細(xì)胞增殖、遷移及裸鼠皮下成瘤能力的影響，分析GSK-3β、FoxO1、C/EBP-δ三者之間的潛在調(diào)控關(guān)系，探討其在ESCC發(fā)生發(fā)展的作用及機(jī)制。
　　方法：
　　1.采用

2、Q-PCR檢測(cè)GSK-3β、FoxO1、C/EBP-δ在ESCC組織及相應(yīng)癌旁組織、不同分化程度ESCC細(xì)胞系中mRNA表達(dá)水平；
　　2.采用Western blotting方法檢測(cè)GSK-3β、FoxO1、C/EBP-δ總蛋白及磷酸化pGSK-3β和磷酸化FoxO1在ESCC組織及相應(yīng)癌旁組織表達(dá)水平；
　　3.采用免疫組化檢測(cè)GSK-3β、FoxO1、C/EBP-δ總蛋白及磷酸化pGSK-3β和磷酸化FoxO1在 ES

3、CC組織及相應(yīng)癌旁組織表達(dá)特征，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析這三個(gè)蛋白之間的相關(guān)性，并分析這些蛋白的表達(dá)與臨床病理特及預(yù)后的相關(guān)性；免疫熒光檢測(cè)GSK-3β、FoxO1、C/EBP-δ總蛋白及磷酸化GSK-3β和磷酸化FoxO1在不同分化程度ESCC細(xì)胞系中定位及表達(dá)特征；
　　4.建立穩(wěn)定沉默GSK-3β或FoxO1基因的ESCC細(xì)胞系KYSE150，分析GSK-3β或FoxO1基因沉默后對(duì)體外細(xì)胞增殖、遷移能力的影響及裸鼠荷瘤模型中皮下成瘤

4、的影響；
　　5.Western blotting檢測(cè)GSK-3β或FoxO1基因沉默后在KYSE150細(xì)胞中GSK-3β、FoxO1、C/EBP-δ核漿分布狀態(tài)，免疫組化分析裸鼠荷瘤組織中GSK-3β、FoxO1、CEBP-δ蛋白表達(dá)水平；
　　6.統(tǒng)計(jì)分析：所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以P＜0.05為差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.Q-PCR和Western blott

5、ing結(jié)果顯示：ESCC中GSK-3βmRNA和蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05），F(xiàn)oxO1和C/EBP-δ mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；低分化ESCC細(xì)胞中GSK-3β mRNA和蛋白表達(dá)顯著高于高、中分化的ESCC細(xì)胞系，F(xiàn)oxO1和C/EBP-δmRNA和蛋白在高分化和中分化中表達(dá)升高。
　　2.免疫熒光顯示：GSK-3β主要定位于胞漿；FoxO1與P-FoxO1（S256）主要定位于胞漿和部分胞核；C/EB

6、P-δ主要定位于胞核。免疫組化結(jié)果顯示：GSK-3β在食管鱗癌組織（64.0％）中陽(yáng)性表達(dá)量顯著高于相應(yīng)癌旁組織（18.0%），且隨著分化程度的降低，GSK-3β陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)逐漸升高；FoxO1在食管鱗癌組織（50.0%）中陽(yáng)性表達(dá)顯著低于相應(yīng)癌旁組織（88.0%），且隨著分化程度的降低，F(xiàn)oxO1陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)逐漸降低；C/EBP-δ在食管鱗癌組織（36.0%）中陽(yáng)性表達(dá)顯著低于相應(yīng)癌旁組織（62.0%）

7、。
　　3.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果：GSK-3β調(diào)控 FoxO1磷酸化出核，胞漿蓄積。當(dāng)GSK-3β表達(dá)量增高時(shí)，胞核中的FoxO1被磷酸化出核，胞漿蓄積。當(dāng)FoxO1蛋白表達(dá)量水平降低時(shí)，C/EBP-δ蛋白表達(dá)量水平一致性降低。
　　4.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：KYSE150-2（GSK3β敲降）組裸鼠腫瘤生長(zhǎng)明顯受到抑制，其腫瘤顯著小于GSK-3β未敲降組，(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.GSK-3β、FoxO1和