多胺類組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶DOT1L抑制劑篩選及誘導(dǎo)混合譜系白血病細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、混合譜系白血?。∕ixed Lineage Leukemia,MLL），因11q23處MLL基因易位重排形成融合蛋白而得名，是一類致死率極高、預(yù)后差的高危惡性急性白血病。DOT1L蛋白是目前發(fā)現(xiàn)的唯一H3K79甲基化轉(zhuǎn)移酶，也是 MLL白血病的重要靶點，開發(fā)DOT1L小分子抑制劑成為治療MLL白血病的一條新思路。多胺類化合物也因其多靶點性成為抗腫瘤藥物的研究熱點，目前對于DOT1L抑制劑的設(shè)計也主要為多胺類衍生物。本課題首先建立組蛋白甲

2、基轉(zhuǎn)移酶DOT1L抑制劑的虛擬篩選方法，篩選出與DOT1L受體對接評分較高的化合物；設(shè)計合成路線合成、分離純化目標(biāo)化合物，并進行結(jié)構(gòu)確認(rèn)；最后考察目標(biāo)化合物對混合譜系白血病細(xì)胞的體外活性研究。研究結(jié)果如下：
　?。?）根據(jù)實驗室前期研究基礎(chǔ)結(jié)合相關(guān)文獻資料，設(shè)計一系列多胺類衍生物，與正處于一期臨床實驗的陽性化合物EPZ-5676共同構(gòu)成配體化合物庫，從蛋白質(zhì)晶體數(shù)據(jù)庫PDB中選取受體模型4HRA。用Sybyl-X2.0軟件將受體與

3、配體進行分子對接試驗，篩選出了分?jǐn)?shù)最高的化合物DUOA003作為目標(biāo)化合物；
　?。?）設(shè)計合成路線并完成目標(biāo)化合物DUOA003的合成工作，通過LC-MS、1HNMR，13CNMR確定目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)為：N,N'-(propane-1,3-diyl)bis(2,5-dihydroxybenzamide)；
　?。?）以混合譜系白血病細(xì)胞MV4-11和巨噬細(xì)胞作為研究對象，采用CCK-8法測定兩株細(xì)胞在目標(biāo)化合物和陽性藥物阿

4、糖胞苷不同濃度（120、100、50、25、10、1、0.1μM）作用24h后的增殖抑制率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)DUOA003和陽性藥物阿糖胞苷對MV4-11細(xì)胞均有顯著的抑制作用，IC50分別為25和28μM，對巨噬細(xì)胞的IC50分別為71μM和11μM；選擇對正常細(xì)胞安全濃度范圍考察不同作用時間24h、48h、72h對細(xì)胞抑制作用的影響，結(jié)果反映出DUOA003對MV4-11細(xì)胞的抑制率展現(xiàn)出時間和劑量的依賴性；
　　（4）采用Annex

5、in V-FITC/PI法對經(jīng)高、中、低濃度的藥物誘導(dǎo)24h和48h的MV4-11細(xì)胞進行染色，在熒光顯微鏡下觀察誘導(dǎo)48h后細(xì)胞狀態(tài)，并用流式細(xì)胞儀檢測目標(biāo)化合物誘導(dǎo)MV4-11細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)DUOA003能夠顯著地誘導(dǎo)MV4-11細(xì)胞產(chǎn)生凋亡。誘導(dǎo)48h后，與陰性對照組(17.3±5％)相比，DUOA003的低濃度組（53.9±8%）、中濃度組（80.9±9%）、高濃度組（88.5±6%）、以及阿糖胞苷高濃度組（82.6±9

6、%）均呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.001），DUOA003誘導(dǎo)的細(xì)胞48h后凋亡多處于晚期，阿糖胞苷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡則主要出現(xiàn)在早期；
　?。?）用Caspase-3活性測定試劑盒，檢測經(jīng)高、中、低濃度的目標(biāo)化合物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡24h后Caspase-3的活性變化。Caspase-3活性檢測顯示化合物DUOA003在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡24后，與陰性對照組Caspase-3活性測定OD值（0.146±0.002）比較，DUOA003的低濃度組（0