MicroRNA-146a通過(guò)抑制TRAF6-NF-κB通路減輕椎間盤(pán)細(xì)胞炎癥反應(yīng).pdf

1、本研究擬通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)，從分子水平來(lái)研究探討MicroRNA-146a在椎間盤(pán)退變性疾病中的調(diào)控機(jī)制，尋找MicroRNA-146a與TRAF6/NF-κB信號(hào)通路交互作用功能分子，為脊椎退變性病變尋找新的治療靶標(biāo)。本研究提出MicroRNA-146a過(guò)表達(dá)可以通過(guò)抑制TRAF6/NF-κB通路減輕椎間盤(pán)退變炎癥反應(yīng)的假設(shè)，期待通過(guò)相應(yīng)的后期實(shí)驗(yàn)證明MicroRNA-146a可作為治療椎間盤(pán)退變的一個(gè)新靶點(diǎn)。
　　目的:

2、>　　1.研究MicroRNA-146a在椎間盤(pán)退變患者體內(nèi)的表達(dá)水平，進(jìn)一步探討椎間盤(pán)退變與MicroRNA-146a表達(dá)水平的關(guān)系。
　　2.通過(guò)人髓核細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)，研究分析MicroRNA-146a和TRAF6、NF-κB的相關(guān)性，進(jìn)一步探討MicroRNA-146a、炎性通路、椎間盤(pán)退變?nèi)咧g的關(guān)系。
　　方法:
　　1.研究對(duì)象選自2013年5月至2014年3月在山東省立醫(yī)院就診患者及健康體檢人員，分為三組

3、;組一為椎間盤(pán)退變患者組，共21例，其中男12例，女9例;年齡18-30歲，平均25.6歲;組二為其他脊柱疾病患者組，共21例，其中男11例，女10例;年齡18-31歲，平均26.1歲;組三為對(duì)照組，健康體檢人群21例。其中男13例，女8例;年齡18-32歲，平均26.7歲。三組人群在年齡，男女比例等方面均無(wú)明顯差異，具有可比性(P＞0.05)。實(shí)時(shí)定量PCR(Quantitive Real-Time PCR，qRT-PCR)比較三組對(duì)

4、象外周血單核細(xì)胞中MicroRNA-146a水平，ELISA法比較三組對(duì)象血清NF-κB、TNF-α和IL-1的水平。將所有得到的結(jié)果數(shù)據(jù)資料輸入SPSS18.0軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)形式來(lái)表示實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)資料，用成組t檢驗(yàn)方法來(lái)對(duì)組間均數(shù)進(jìn)行比較，如果P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2.選擇人髓核細(xì)胞株(Nucleus Pulposus Cells，NP-CELLS)，HNPC4800，放置在DMEM

5、培養(yǎng)基中，并在溫育箱中進(jìn)行培養(yǎng)。載體系統(tǒng)的組成包含了載體成分和包裝成分:MicroRNA-146a mimic（模擬物）和不含有MicroRNA-146a的空白質(zhì)粒;包裝質(zhì)粒pHelper1.0和pHelper2.0。這些包裝質(zhì)粒提供了病毒包裝所需要的結(jié)構(gòu)蛋白和包膜蛋白。將NP細(xì)胞根據(jù)本實(shí)驗(yàn)要求因素的不同，進(jìn)行相應(yīng)不同的干預(yù)和處理，總共分為以下4組:MicroRNA-146a組給予包含NPMicroRNA-146a siRNA序列的載體

6、干預(yù);NC(Negative Control，NC)組給予包含不對(duì)任何基因產(chǎn)生干擾作用的無(wú)意義陰性對(duì)照;LPS(Lipopolysaccharide，LPS，脂多糖)組是對(duì)siRNA序列的載體干預(yù)的細(xì)胞進(jìn)行LPS刺激;BL組是空白細(xì)胞組，只在相同的培養(yǎng)條件下觀察而不做任何干預(yù)處理。將所有實(shí)驗(yàn)細(xì)胞在處理時(shí)均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染人髓核細(xì)胞(NP cells)，測(cè)試轉(zhuǎn)染率，經(jīng)LPS(10μM)刺激以誘導(dǎo)炎癥。qRT-PCR檢測(cè)MicroRNA-

7、146a在NP cells中的表達(dá)水平，用qRT-PCR和Western blot檢測(cè)NP cells中的TNF-α、TRAF6和NF-κB的基因和蛋白表達(dá)，以及MicroRNA-146a和TNF-α、TRAF6和NF-κB的相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，電腦掃描記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果的X光膠片，BandScan5.0圖像分析軟件讀取膠片上各蛋白條帶的灰度值，內(nèi)參數(shù)為β-actin，在本實(shí)驗(yàn)中將目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量用目的條帶和空白對(duì)照條帶比值的形式來(lái)表示

8、，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)資料均采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件來(lái)進(jìn)行分析處理，本實(shí)驗(yàn)中的數(shù)據(jù)資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((X)±s)的形式來(lái)表示。在本實(shí)驗(yàn)中，兩組間的比較采用的是兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法，多組別間的比較采用的是單因素方差分析(One Way ANOVA)方法，如果P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果:
　　1.三組研究對(duì)象的MicroRNA-146a表達(dá)水平比較，椎間盤(pán)退變患者組的MicroRNA-146a表達(dá)為1.092

9、±0.453mol/L，明顯低于其他兩組（其他脊柱疾病患者組2.871±1.265mol/L，對(duì)照組3.122±2.132mol/L），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而對(duì)照組和其他脊柱疾病患者組相比，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。三組研究對(duì)象的NF-κB表達(dá)水平比較，椎間盤(pán)退變患者組表達(dá)為137.52±11.45mg/L，明顯高于其他兩組（其他脊柱疾病患者組25.12±10.36mol/L，對(duì)照組28.11±3.87mol/L

10、），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而對(duì)照組和其他脊柱疾病患者組相比，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。三組研究對(duì)象的TNF-α表達(dá)水平比較，椎間盤(pán)退變患者組表達(dá)為257.12±10.43mg/L，明顯高于其他兩組(其他脊柱疾病患者組127.21±21.37mol/L，對(duì)照組118.12±7.56mol/L)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而對(duì)照組和其他脊柱疾病患者組相比，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。而三組的IL-1表達(dá)

11、水平相比（椎間盤(pán)退變患者組124.27±11.25mol/L，其他脊柱疾病患者組110.34±7.57mol/L，對(duì)照組120.12±4.58mol/L)，差異均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，椎間盤(pán)退變患者組MicroRNA-146a表達(dá)量明顯低于其他脊柱疾病患者組及對(duì)照組，且NF-κB、TNF-α表達(dá)量明顯高于其他兩組。
　　2.將已經(jīng)線性化的MicroRNA-146a mimic載體與合成的DNA olig

12、o經(jīng)過(guò)連接及轉(zhuǎn)化，然后將含有NP-siRNA序列的重組質(zhì)粒抽取出來(lái)之后再經(jīng)過(guò)測(cè)序，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示重組質(zhì)粒符合對(duì)本研究的設(shè)計(jì)要求。本實(shí)驗(yàn)將攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP)報(bào)告基因的載體MicroRNA-146a mimic進(jìn)行包裝而成為載體顆粒，當(dāng)感染細(xì)胞后而在其中表達(dá)EGFP，在倒置熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)其發(fā)綠色熒光。然后進(jìn)行相應(yīng)的的預(yù)實(shí)驗(yàn)條件篩查后表現(xiàn)為，在6孔板中每孔細(xì)

13、胞數(shù)為1×105個(gè)，觀察到細(xì)胞融合度在轉(zhuǎn)染時(shí)可以達(dá)到30％—50％，并且當(dāng)感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)=50，polybrene5ug/mL的時(shí)候可以得到較高的感染效率。
　　將各組細(xì)胞的總RNA抽提后，再用2％瓊脂糖凝膠、100V恒壓電泳進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，研究結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)中總RNA的完整性均較好，其中RNA顯示的3條帶亮度分別是28S＞18S＞5S，如圖3。然后通過(guò)核酸蛋白檢測(cè)儀進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)

14、，結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)總的RNA沒(méi)有發(fā)生降解，并且RNA的純度也滿足本研究要求，其實(shí)驗(yàn)樣本的光密度值OD260/OD280在1.8～2.0之間。qRT-PCR檢測(cè)MicroRNA-146a，TRAF6和NF-κB等基因表達(dá)水平結(jié)果顯示，MicroRNA-146a的低表達(dá)和TRAF6、NF-κB的高表達(dá)有明顯的相關(guān)性。
　　使用Western blot方法來(lái)檢測(cè)分析本研究中各組細(xì)胞的蛋白表達(dá)水平，本實(shí)驗(yàn)將3-actin作為內(nèi)參，將空白細(xì)胞

15、組在相同觀察時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量做為100％，并且利用以下公式來(lái)計(jì)算各組TRAF6及NF-κB的相對(duì)表達(dá)量:TRAF6及NF-κB的表達(dá)率(％)=100％×（干預(yù)組表達(dá)量/空白組表達(dá)量），在研究分析獲得的各組細(xì)胞TRAF6和NF-κB蛋白表達(dá)情況后，發(fā)現(xiàn)兩者之間在LPS組都顯示較高蛋白濃度，說(shuō)明了這兩者與MicroRNA-146a的表達(dá)呈現(xiàn)相關(guān)性，抑制MicroRNA-146a的表達(dá)可以上調(diào)TRAF6和NF-κB的表達(dá)水平，說(shuō)明MicroRN

16、A-146a與TRAF6和NF-κB之間呈負(fù)相關(guān)。MicroRNA-146a過(guò)表達(dá)可以顯著降低LPS刺激的NP細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子的水平，并下調(diào)TRAF6和NF-κB的mRNA和蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)論:
　　1.MicroRNA-146a表達(dá)量可能與椎間盤(pán)細(xì)胞炎癥反應(yīng)相關(guān)。
　　2.MicroRNA-146a過(guò)表達(dá)可能會(huì)減輕椎間盤(pán)細(xì)胞炎癥反應(yīng)。
　　3.TRAF6/NF-κB途徑的關(guān)鍵因子、蛋白水平與MicroR