鐵過負荷肝臟炎癥反應(yīng)與miR-146α-TRAF6-NF-κB信號通路關(guān)系研究.pdf

1、研究背景：
　　眾所周知，鐵作為人體的必需微量元素，在氧轉(zhuǎn)運，能量代謝和DNA合成等多個生理過程中起著重要的作用。雖然鐵的攝入對機體是必不可少的，但是鐵攝入過多會對機體產(chǎn)生危害，影響多種急慢性病癥的發(fā)生發(fā)展。肝臟作為鐵貯存的主要器官，在鐵代謝中發(fā)揮著中樞調(diào)節(jié)作用，鐵過負荷會對肝臟產(chǎn)生很大的危害。有研究發(fā)現(xiàn)，鐵代謝紊亂可以引起肝臟炎癥反應(yīng)，是導致肝纖維化，肝細胞癌變或肝功能衰竭的重要原因之一。
　　過去研究表明，鐵過負荷fen

2、ton反應(yīng)，產(chǎn)生氧自由基，激活巨噬細胞，產(chǎn)生大量炎癥因子，引起炎癥反應(yīng)。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，鐵過負荷可以影響肝臟組織細胞microRNA表達變化。肝臟組織細胞miR-146α，122，155，132，34α在肝臟炎癥發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，肝鐵過負荷引起的miR-122表達降低，與肝臟的炎癥發(fā)生有關(guān)，但是過表達miR-122只能部分緩解肝鐵過負荷導致的炎癥，因此我們推測除了miR-122外，鐵過負荷還會影響到其他與

3、肝臟炎癥反應(yīng)有關(guān)的microRNA表達。
　　本課題首先利用芯片技術(shù)觀察不同鐵負荷2周小鼠肝臟基因和miRNAs表達變化特點，尋找目標基因及其可能存在的相互聯(lián)系;在發(fā)現(xiàn)鐵過負荷可引起miR-146α/TRAF6/NF-κB信號通路關(guān)鍵分子表達變化基礎(chǔ)上，進一步分析鐵過負荷肝細胞miR-146α表達下降的分子機制及其在肝臟炎癥反應(yīng)中的作用。
　　研究目的：
　　本課題通過體內(nèi)體外實驗，明確鐵過負荷肝臟組織細胞內(nèi)與炎癥相關(guān)

4、的microRNA表達變化的特點;篩選目標microRNA（miR-146α等），并分析其在肝臟炎癥反應(yīng)中的作用;在此基礎(chǔ)上，進一步通過分子生物學技術(shù)，闡明鐵過負荷引起目標microRNA表達變化的機制，為尋找鐵過負荷相關(guān)疾病防治潛在靶點提供實驗依據(jù)。
　　研究方法：
　　一、實驗動物分組及處理
　?。ㄒ唬┎煌F負荷小鼠肝臟基因和miRNAs芯片檢測
　　將雄性C57小鼠隨機分為三組:缺鐵組(Iron defic

5、iency，ID)，對照組(Control，CTRL)，鐵過負荷組(Iron overload，IO)，三組小鼠自由飲水（去離子水）。進食純化飼料（含鐵量3ppm/kg，成分組成見附錄），對照組小鼠按照20mg/kg腹腔注射右旋糖酐鐵（濃度為2mg/ml），每周兩次;鐵過負荷組小鼠按照200mg/kg腹腔注射右旋糖酐鐵（濃度為20mg/ml），每周兩次。缺鐵組小鼠按照相同體積腹腔注射0.9％生理鹽水，每周兩次。連續(xù)2周造模，麻醉處死小鼠

6、，收集肝臟組織樣本。
　?。ǘ╄F過負荷對肝臟miR-146α/TRAF6/NF-κB信號通路關(guān)鍵分子的影響
　　1.不同鐵制劑對小鼠肝臟炎癥反應(yīng)的影響
　　將雄性C57小鼠隨機分為以下四組:對照組(Control，CTRL)，右旋糖酐組(Dextran，DEXT)，右旋糖酐鐵組(Dextran-iron，DEIR)和蔗糖鐵組(Sucrose-iron，SUIR)，均喂食全價飼料。按照同上方法連續(xù)4周造模，麻醉處死小鼠

7、，收集肝臟組織樣本。
　　2.鐵過負荷不同時間段對肝臟炎癥影響
　　將雄性C57小鼠隨機分為兩組:對照組(Control，CTRL)，鐵過負荷組(Ironoverload，IO)，所有小鼠均喂養(yǎng)純化飼料，每組又分為三個亞組:飼養(yǎng)1周組，飼養(yǎng)2周組，和飼養(yǎng)4周組。按照同上方法造模，麻醉處死小鼠，收集肝臟組織樣本。
　　二、細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染
　?。ㄒ唬┘毎甑倪x擇
　　人肝癌細胞Huh7，HepG2，LX-2培養(yǎng)

8、在含10％胎牛血清，1％雙抗（青鏈霉素混合液）的高糖DMEM中，人肝細胞L02培養(yǎng)在含10％胎牛血清，1％雙抗的高糖1640中。
　　（二）分組
　　按照實驗的要求，選擇相應(yīng)的細胞株，進行不同時間、不同濃度的暴露后收集細胞備用。
　?。ㄈ┺D(zhuǎn)染
　　將Huh7細胞或HepG2細胞接種到培養(yǎng)板上，當融合度為80％時，進行轉(zhuǎn)染，用DMEM或1640培養(yǎng)液將過表達目的基因或miRNA和抑制目的基因或miRNA的inhi

9、bitor或干擾小RNA稀釋后混勻，37℃孵育15-20分鐘。根據(jù)使用的培養(yǎng)板，先在每孔中加入不含雙抗的培養(yǎng)液，再加入混合液，37℃孵育，6-8h后換新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)后48h后用做實驗。
　　二、基因和microRNA表達譜芯片檢測
　　采用Affymetrix GeneChip Mouse Gene1.0 ST Array和miRNA3.0 Array，分別檢測鐵過負荷2周組和對照2周組C57小鼠肝臟基因和microRNA

10、s，表達，然后采用隨機方差模型(RVM)來進行差異基因和microRNA篩選，分析工具為MultiClassDif。
　　四、血清鐵相關(guān)生化指標測定
　　全自動生化分析儀測定ALT、AST、血清鐵、TIBC、TS的水平。
　　五、小鼠肝臟普魯士藍染色方法
　　肝臟樣本在4％多聚甲醛溶液中進行固定，然后包埋，切片，最后用普魯士藍染色，顯微鏡鏡下觀察，并采集圖像。
　　六、小鼠肝臟HE染色及炎癥病理評分方法

11、r>　　肝臟樣本4％多聚甲醛固定，包埋，切片后，用蘇木精和伊紅染色，顯微鏡鏡下觀察，并采集圖像，采用Knodell法進行肝臟炎癥病理評分。
　　七、實時定量熒光PCR
　　提取肝臟或細胞總RNA測定濃度后，反轉(zhuǎn)成CDNA，將cDNA與引物，SYBRgreen除酶水一起配好反應(yīng)體系后實時定量PCR進行擴增，根據(jù)CT值進行分析。
　　八、Western-blot
　　提取肝臟組織或細胞總蛋白并測定濃度后，變性，凝膠電

12、泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗，二抗孵育后，顯影。
　　九、染色質(zhì)免疫共沉淀法(ChIP)
　　Huh7接種到培養(yǎng)皿中，一組加PBS作為對照，另一直加holo-tf，孵育24h后，分別進行細胞的甲醛交聯(lián)與超聲破碎，蛋白/DNA沉淀，洗脫，DNA純化，PCR擴增目的基因，檢測擴增產(chǎn)物。
　　十、數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析
　　實驗數(shù)據(jù)用（(X)±SEM）表示。使用Quantity one圖像分析系統(tǒng)分析Western blot條帶;應(yīng)

13、用Graphpad Prism6.0軟件進行實驗數(shù)據(jù)分析，采用兩獨立樣本t檢驗和單因素方差分析(one-way ANVOA)分析各組之間的差異，各組間兩兩比較采用Tukeypost-hoc檢驗。結(jié)果以P＜0.05為顯著性水平。
　　結(jié)果：
　　一、不同鐵負荷小鼠肝臟基因和miRNAs芯片檢測
　?。ㄒ唬┎煌F負荷小鼠肝臟基因表達譜檢測
　　通過基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)，不同鐵負荷2周小鼠肝臟有3282個基因表達出現(xiàn)差異，

14、其中中包括NF-κB信號通路關(guān)鍵分子TLR4、TRAF6、NF-κBia顯著升高，鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)控分子鐵調(diào)素(HAMP)，鐵蛋白輕鏈(FTL1)顯著升高，而轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TRFC）顯著降低。
　?。ǘ┎煌F負荷小鼠肝臟microRNAs變化
　　鐵負荷2周后，缺鐵組，對照組和鐵過負荷組小鼠肝臟中有差異的microRNA有68種，其中包括TRAF6的調(diào)控因子miR-146α，說明miR-146α可能跟肝臟炎癥有關(guān)。
　?。ㄈ?/p>

15、）PCR驗證芯片結(jié)果
　　實驗結(jié)果表明，與對照組相比，miR-146α表達明顯降低，鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)控分子出現(xiàn)明顯變化，進一步證實小鼠肝臟處于鐵過負荷狀態(tài)，NF-κB信號通路關(guān)鍵分子TLR4，TRAF6表達升高，上述結(jié)果與芯片檢測結(jié)果一致。
　　二、鐵過負荷對肝臟miR-146α/TRAF6/NF-κB信號通路的影響
　?。ㄒ唬┎煌F制劑對肝臟炎癥反應(yīng)的影響
　　為了進一步確定急性IO（而不是鐵劑的其它結(jié)合成分）可引起肝

16、組織炎癥反應(yīng)，建立正確的鐵過負荷小鼠模型，我們比較了右旋糖苷（鐵載體）、右旋糖酐鐵、蔗糖鐵，對小鼠肝鐵蓄積和炎癥的影響，結(jié)果表明，與對照組和右旋糖酐組相比，注射右旋糖酐鐵和蔗糖鐵組小鼠均能提高血清鐵和轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度，和肝臟鐵，血清鐵蛋白水平，同時肝臟出現(xiàn)明顯鐵蓄積和炎癥反應(yīng)，我們選取右旋糖酐鐵作為鐵過負荷制劑，建立小鼠鐵過負荷模型。
　?。ǘ╄F過負荷不同時間段小鼠肝臟鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)控分子，miR-146α/TRAF6/NF-κB信號通

17、路和下游炎癥因子的表達變化
　　為了進一步觀察整體水平肝組織miR-146α表達變化在IO引起炎癥過程中的作用，我們比較了1，2，4周鐵過負荷小鼠穩(wěn)態(tài)調(diào)控基因，miR-146α/TRAF6/NF-κB信號通路和下游炎癥因子的表達變化，實驗結(jié)果表明1-4周鐵過負荷小鼠肝臟鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)控分子基因出現(xiàn)相應(yīng)變化，同時可見miR-146α下降，NF-κB信號通路關(guān)鍵分子基因和蛋白表達升高，與芯片結(jié)果一致。
　　三、鐵過負荷影響miR-14

18、6α/TRAF6/NF-κB信號通路的分子機制
　?。ㄒ唬╄F過負荷miR-146α表達降低對肝細胞TRAF6/NF-κB信號通路活性的影響
　　1、不同濃度Holo-tf對Huh7細胞miR-146α表達影響
　　為了確定細胞實驗Holo-Tf的劑量，我們將Huh7細胞分別暴露于0，15，30，60μM濃度下，實驗結(jié)果表明，30μM Holo-tf就可以誘導Huh7細胞miR-146α降低。
　　2、鐵過負荷對不

19、同人肝細胞株miR-146α表達影響
　　為了確定鐵過負荷引起的miR-146α變化是否存在細胞特異性，我們將在Huh7，HepG2，L02，LX-2細胞在含30μM Holo-Tf細胞培養(yǎng)液中暴露24h，實驗結(jié)果表明鐵過負荷可引起上述細胞株鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)因子表達發(fā)生相應(yīng)變化，同時伴有miR-146α明顯下降。
　　3、鐵過負荷引起miR-146α降低對TRAF6/NF-κB信號通路活性的影響
　　Huh7和HepG2細胞

20、在添加30μM Holo-tf培養(yǎng)液暴露24h，結(jié)果顯示上述細胞miR-146α表達降低，NF-κB信號通路關(guān)鍵分子TLR4，TRAF6，MYD88，p65、炎癥因子TNFα，IL6蛋白和mRNA表達升高。
　　為了了解鐵過負荷狀態(tài)下，miR-146α與TRAF6/NF-κB信號通路關(guān)鍵分子表達的時間順序，我們將huh7細胞在添加30μM Holo-tf培養(yǎng)液分別暴露0，2，4，8，12，24，36，48h，實驗結(jié)果表明pri-m

21、iR-146α和miR-146α表達在2h開始降低，并隨著時間延長進一步降低;而TLR4，TRAF6，p65表達在12h開始升高，TNFα和IL-6的表達在24h開始升高，隨著時間延長進一步升高。
　　4、過表達miR-146α對鐵過負荷下huh7細胞NF-κB信號通路關(guān)鍵分子的影響
　　為了明確鐵過負荷miR-146α表達變化與NF-κB信號通路活性變化的關(guān)系，我們通過轉(zhuǎn)染過表達miR-146α，實驗結(jié)果表明，過表達miR

22、-146α，可以抑制鐵過負荷Huh7細胞NF-κB信號通路關(guān)鍵分子TRAF6，可以部分抑制下游炎癥因子表達升高幅度。而同時過表達miR-146α，122可以明顯緩解鐵過負荷引起的TNFa升高。
　?。ǘ╄F過負荷引起肝細胞mir-146α表達下降的分子機制
　　1、鐵過負荷下引起miR-146α表達變化的轉(zhuǎn)錄因子篩選
　　將huh7和hepG2細胞在添加30μM Holo-tf培養(yǎng)液暴露24h，結(jié)果顯示，鐵過負荷對轉(zhuǎn)錄

23、因子STAT3，PU.1，CEBPβ表達無影響，HNF4α表達明顯降低，將huh7細胞在在添加30μM Holo-tf培養(yǎng)液分別暴露0～48h，結(jié)果HNF4α在2h明顯下降，隨著鐵過負荷時間的延長，HNF4α表達逐步降低。
　　2、轉(zhuǎn)錄因子HNF4α對miR-146α表達的調(diào)控作用
　　首先通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)過表達HNF4α，huh7細胞miR-146α表達升高;抑制HNF4α，miR-146α表達降低;然后將過表達HNF4

24、α的Huh7細胞在添加30μM Holo-tf培養(yǎng)液暴露24h，與空載質(zhì)粒組相比，miR-146α表達明顯下降。染色質(zhì)免疫共沉淀實驗結(jié)果表明，鐵過負荷時huh7細胞HNF4α與miR-146α結(jié)合活性明顯減弱。
　　3、HIF1α和miR-34α表達變化對鐵過負荷下肝細胞HNF4α表達的影響
　　為了進一步闡明鐵過負荷引起HNF4α/miR-146α表達降低的機制，我們檢測了鐵過負荷狀態(tài)下對HNF4α調(diào)控因子表達的影響，實驗

25、結(jié)果表明與對照組相比，鐵過負荷狀態(tài)下c-fos，c-jun，TCF4等轉(zhuǎn)錄因子表達無明顯變化，但鐵過負荷可以引起對HNF4α有負性調(diào)控作用的miR-34α表達明顯增加。在此基礎(chǔ)上，我們通過轉(zhuǎn)染miR-34αinhibitor，發(fā)現(xiàn)抑制了miR-34α表達，HNF4α表達明顯升高。
　　已知，具有鐵感受作用的HIF1α對miR-34α存在轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。因此，我們通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)過表達HIF1α，huh7細胞miR-34α表達升高，

26、HNF4α和miR-146α明顯降低;抑制HIF1α，miR-34α表達明顯降低，HNF4α和miR-146α表達明顯升高;在此基礎(chǔ)上抑制HIF1α的Huh7細胞在添加30μM Holo-tf培養(yǎng)液暴露24h，與空載質(zhì)粒組相比，HNF4α表達明顯升高。
　　結(jié)論：
　　一、miR-146α表達降低，TRAF6/NF-κB(p65)依賴性炎癥因子的表達升高，是鐵過負荷引起肝臟組織細胞出現(xiàn)炎癥反應(yīng)的重要途徑之一;
　　二、