ω3多不飽和脂肪酸改善失血休克大鼠心肌收縮功能的作用與機(jī)制.pdf

1、心肌收縮功能在維持血流動(dòng)力學(xué)、組織灌流中起著主要作用。失血性休克時(shí)，因有效循環(huán)血量降低，直接引起低血壓，導(dǎo)致胃腸道的缺血缺氧，細(xì)菌及內(nèi)毒素等有害物質(zhì)經(jīng)過(guò)腸淋巴系統(tǒng)進(jìn)入血液，通過(guò)多種途徑參與心肌的損傷，最終導(dǎo)致心肌功能障礙。因此，休克救治的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是如何改善心肌收縮功能障礙，恢復(fù)心泵功能。可見(jiàn)，深入探索休克后心肌收縮功能障礙的發(fā)生機(jī)制，對(duì)于尋找心肌干預(yù)措施、防治重癥休克及其導(dǎo)致的多器官功能障礙具有重要的臨床意義。
　　ω3多不飽和脂

2、肪酸(ω-3PUFAs)作為一種營(yíng)養(yǎng)素以及細(xì)胞膜成分之一，除了參與脂類介質(zhì)合成外，還參與了炎癥因子的生成與釋放過(guò)程，進(jìn)而調(diào)控炎癥反應(yīng)，影響某些免疫細(xì)胞的功能，同樣還發(fā)揮著改善腸屏障功能的作用。細(xì)胞自噬在各種生命活動(dòng)中，具有重要病理生理意義，參與了多種疾病的發(fā)生與發(fā)展;同樣，細(xì)胞自噬在失血性休克后器官損傷的發(fā)病學(xué)中具有一定的作用。但是，ω-3PUFAs是否能改善失血性休克后的心肌收縮功能，其作用機(jī)制是否與細(xì)胞自噬有關(guān)？未見(jiàn)報(bào)道。
　

3、　為此，本實(shí)驗(yàn)在觀察ω-3PUFAs對(duì)失血性休克大鼠存活時(shí)間與生存率作用的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究ω-3PUFAs及自噬工具藥對(duì)失血性休克大鼠心肌組織損傷、收縮功能、細(xì)胞自噬的作用，并從腸損傷角度探討其相關(guān)機(jī)制，以期為防治失血性休克引起的心肌收縮功能障礙提供一定的實(shí)驗(yàn)資料。
　　首先，建立失血性休克大鼠模型。將健康雄性大鼠放入美國(guó)MATRX動(dòng)物麻醉機(jī)的塑料盒中吸入3％異氟烷誘導(dǎo)麻醉，氧流量控制在1～1.5L/min，1～3min進(jìn)入手術(shù)

4、需要的麻醉狀態(tài)，將大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上并連接大鼠專用無(wú)創(chuàng)氧氣面罩，轉(zhuǎn)入1.5％異氟烷維持麻醉狀態(tài)。然后，實(shí)施雙側(cè)股動(dòng)脈及單側(cè)股靜脈插管，備放血及肝素抗凝。手術(shù)結(jié)束后，穩(wěn)定30min,大鼠在清醒狀態(tài)下，10min內(nèi)勻速放出大鼠全身血量的40％、維持低血壓1h后進(jìn)行液體復(fù)蘇，建立清醒失血性休克大鼠模型。
　　將12只健康雄性大鼠分成兩個(gè)組，分別是休克組(shock)、Shock+ω-3PuFAs組，觀察ω-3PuFAs對(duì)失血性休克

5、大鼠存活時(shí)間與存活率的作用;結(jié)果顯示，Shock組的6只大鼠在30h內(nèi)死亡，Shock+ω-3PuFAs治療組3只大鼠的存活時(shí)間均超過(guò)了50h，其余3只在30h內(nèi)死亡。研究結(jié)果提示ω-3PuFAs對(duì)失血性休克具有良好的干預(yù)作用。
　　為進(jìn)一步驗(yàn)證ω-3PUFAs對(duì)失血性休克大鼠心肌收縮功能的作用，取12只健康大鼠常規(guī)方法建立失血性休克模型，液體復(fù)蘇后行腸淋巴管插管，留取休克腸淋巴液(PHSML)，用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究;然后將48只大

6、鼠隨機(jī)分為8組:假手術(shù)組(Sham)、Sham+ω-3PuFAs組、Shock組、Shock+ω-3PuFAs組、Shock+PHSML+ω-3PuFAs組、Shock+3-甲基腺嘌呤(3-MA)組、Shock+ω-3PUFAs+雷帕霉素(RAPA)組，Shock+ω-3PUFAs+3-MA+PHSML組，每組6只。其中，Shock組、Shock+ω-3PuFAs組、Shock+PHSML+ω-3PuFAs組、Shock+3-MA組、S

7、hock+ω-3PUFAs+RAPA組、Shock+ω-3PUFAs+PHSML+3-MA組按前述方法建立清醒失血性休克模型，維持低血壓60min后行液體復(fù)蘇:Shock組輸入放出全血加等量復(fù)方氯化鈉液;Shock+ω-3PuFAs組輸入放出全血加含有ω-3PuFAs(0.2g/kg)等量復(fù)方氯化鈉液;Shock+ω-3PuFAs+PHSML組輸入放出全血及含有ω-3PuFAs(0.2g/kg)、PHSML(1ml/kg)等量復(fù)方氯化鈉

8、液;Shock+RAPA+ω-3PUFAs組在輸入放出全血及含有ω-3PuFAs(0.2g/kg)等量復(fù)方氯化鈉液的同時(shí)，腹腔注射RAPA（10mg/kg）;Shock+ω-3PUFAs+PHSML+3-MA組輸入放出全血及含有ω-3PuFAs(0.2g/kg)、3-MA(30mg/kg)、PHSML(1ml/kg)等量復(fù)方氯化鈉液;Shock+3-MA組輸入放出全血及包含3-MA（30mg/kg）的等量復(fù)方氯化鈉液。Sham組、Sha

9、m+ω-3PuFAs組大鼠實(shí)施與休克組同樣手術(shù)、但不放血;在與Shock組進(jìn)行液體復(fù)蘇相同的時(shí)間內(nèi)，Sham組靜脈輸入等血量復(fù)方氯化鈉液、Sham+ω-3PuFAs組靜脈輸入含有ω-3PuFAs（0.2g/kg）的等量復(fù)方氯化鈉液。
　　在液體復(fù)蘇結(jié)束后3h或相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，行胸、腹部手術(shù)，經(jīng)腹主動(dòng)脈穿刺留取全血標(biāo)本，制備血漿，用于檢測(cè)生化指標(biāo);然后，快速剪下心臟測(cè)定離體心臟收縮功能，待離體心臟灌流之后留取心室一部分置于4％的多聚甲醛

10、中，用于觀察組織形態(tài)學(xué)以及應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)細(xì)胞自噬標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3Ⅱ)表達(dá)，其它心臟組織凍存于低溫冰箱中;同時(shí)，留取腸組織（回盲部10cm），取2cm測(cè)腸濕重，烤干后測(cè)干重，計(jì)算濕/干比，取2cm腸固定于4％多聚甲醛中，用于組織形態(tài)學(xué)觀察。
　　研究結(jié)果表明，失血性休克大鼠血漿CK-MB、LDH-L活性均顯著高于Sham與Sham+ω-3PUFAs組;ω-3PUFAs治療降低了失血性休克大鼠血漿CK-M

11、B、LDH-L活性，3-MA治療對(duì)二者無(wú)明顯作用;靜脈輸入休克腸淋巴液廢除了ω-3PUFAs降低失血性休克大鼠血漿CK-MB、LDH-L活性的作用;RAPA抑制了ω-3PUFAs降低失血性休克大鼠血漿CK-MB、LDH-L活性的作用;3-MA治療卻進(jìn)一步提高了靜脈輸入休克腸淋巴液對(duì)提高大鼠血漿CK-MB的負(fù)性作用。此外，失血性休克引起了大鼠心肌組織肌絲斷裂、水腫，增加了LC3-Ⅱ表達(dá);ω-3PUFAs及3-MA治療可明顯改善心肌細(xì)胞損傷

12、，降低LC3-Ⅱ表達(dá);靜脈輸入PHSML及RAPA治療均抑制了ω-3PUFAs的有利作用;3-MA治療對(duì)靜脈輸入PHSML有一定的抑制作用。
　　離體心臟功能結(jié)果顯示，失血性休克大鼠離體心臟的±dP/dt max以及LVSP均顯著低于Sham與Sham+ω-3PUFAs組，HR與LVEDP未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;ω-3PUFAs治療提高了失血性休克大鼠離體心臟的±dP/dt max以及LVSP;此外，靜脈輸入休克腸淋巴液廢除了ω-3PUF

13、As對(duì)失血性休克大鼠離體心臟的有利作用，表現(xiàn)在顯著降低了±dP/dt max以及LVSP水平。自噬特異性抑制劑3-MA提高了失血性休克大鼠離體心臟的±dP/dt max以及LVSP，對(duì)HR與LVEDP無(wú)明顯作用;自噬激活劑RAPA對(duì)失血性休克大鼠經(jīng)ω-3PUFAs治療后離體心臟的±dP/dt max、LVSP、HR與LVEDP均無(wú)明顯作用;3-MA治療進(jìn)一步抑制了靜脈輸入休克腸淋巴液對(duì)大鼠離體心臟的負(fù)性作用，表現(xiàn)在顯著提高±dP/dt

14、max以及LVSP、降低LVEDP水平。
　　針對(duì)腸損傷研究的指標(biāo)顯示，失血性休克大鼠腸組織評(píng)分、濕干比值均顯著高于Sham與Sham+ω-3PUFAs組;ω-3PUFAs與3-MA治療降低了失血性休克大鼠腸組織評(píng)分、濕干比值;靜脈輸入PHSML廢除了ω-3PUFAs降低失血性休克大鼠腸組織評(píng)分、濕干比值的作用;3-MA治療進(jìn)一步抑制了靜脈輸入PHSML對(duì)提高大鼠腸組織評(píng)分、濕干比值的負(fù)性作用。同時(shí)，失血性休克大鼠血漿D-LA、I

15、-FABP水平均顯著高于Sham與Sham+ω-3PUFAs組;ωω-3PUFAs與3-MA治療降低了失血性休克大鼠血漿D-LA、I-FABP水平;靜脈輸入休克腸淋巴液廢除了ω-3PUFAs降低失血性休克大鼠血漿D-LA水平的作用，對(duì)I-FABP無(wú)明顯作用;3-MA治療卻進(jìn)一步提高了靜脈輸入休克腸淋巴液對(duì)提高大鼠血漿D-LA、I-FABP的負(fù)性作用。
　　上述研究表明，ω-3PUFAs提高失血性休克大鼠的存活時(shí)間，改善大鼠休克后心