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文檔簡介
1、背景與目的:細胞自噬是一種將細胞內(nèi)容物運送到溶酶體進行降解的程序性細胞死亡方式,誘導或抑制自噬都會導致癌細胞的死亡。目前研究者已經(jīng)證實在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中自噬活性具有兩面性,既有促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用,也有抑制腫瘤生長誘導其細胞死亡的作用,自噬與腫瘤的關(guān)系十分復雜,也存在著不少的分歧。本課題通過比較白血病多藥耐藥 K562/ADM細胞及其親本 K562細胞對植物抗毒素白藜蘆醇的敏感性,以及白藜蘆醇誘導的自噬活化與細胞凋亡作用,探討白藜
2、蘆醇誘導的白血病細胞自噬活性與細胞凋亡之間的關(guān)系,探討白藜蘆醇誘導耐藥性白血病細胞凋亡的自噬機制,為臨床克服白血病細胞耐藥性、提高耐藥性白血病細胞的藥物敏感性提供理論基礎。
方法:MTT比色檢測藥物對細胞的增殖抑制,透射電鏡和 MDC熒光染色觀察細胞自噬形態(tài)學的改變,Western-blotting檢測自噬相關(guān)蛋白 LC3、Beclin-1及P62的表達。FCM檢測細胞周期變化,流式細胞術(shù)AnnexinV/PI雙染檢測細胞凋亡
3、率,Western-blotting和流式細胞術(shù)檢測凋亡相關(guān)蛋白 caspase-3、Bcl-2、Bax和細胞色素c(Cyt c)、組織蛋白酶D(Cath D)以及P-糖蛋白(P-gp)的表達,F(xiàn)CM檢測活性氧的變化水平。
結(jié)果:1. MTT實驗表明,不同濃度的白藜蘆醇對白血病耐藥細胞K562/ADM及敏感細胞K562均具有增殖抑制作用。K562細胞48h的IC50值為46.67±0.38μmol/L,而K562/ADM細胞的
4、IC50值為57.71±0.67μmol/L,可以看出K562/ADM細胞對白藜蘆醇具有一定的耐受性。
2.透射電鏡和MDC熒光染色結(jié)果顯示,白藜蘆醇作用兩種細胞后胞內(nèi)自噬泡數(shù)目均明顯增多,核周的點狀熒光強度也增高,且 K562/ADM細胞較其親本K562細胞自噬泡增多明顯。WB檢測結(jié)果顯示不同濃度的白藜蘆醇作用細胞后, K562/ADM細胞中與對照組相比自噬標志蛋白LC3、Beclin-1的表達明顯上調(diào),而P62蛋白在72h
5、后表達不足對照組的三分之一;而敏感細胞K562內(nèi)LC3和Beclin1的表達量也有輕度上調(diào),但低于耐藥細胞株,P62的表達變化不是很明顯。
3.白藜蘆醇誘導K562/ADM細胞和K562細胞發(fā)生凋亡。流式細胞儀檢測兩種細胞株的總凋亡率均明顯升高,并且呈濃度依賴性;細胞周期發(fā)生明顯變化, G0/G1期細胞逐漸增多,而S期細胞減少(P<0.05),且對K562細胞的周期阻滯作用更明顯;同時對凋亡相關(guān)分子的檢測也顯示藥物作用兩種細胞
6、后可促進caspase-3的活化、降低Bcl-2/Bax比值,并伴有Cyt c釋放增加及ROS產(chǎn)生增多。這些結(jié)果與WB結(jié)果相一致。令人關(guān)注的是我們的實驗證實Cathepsin D經(jīng)藥物作用后,在耐藥細胞K562/ADM中的表達顯著上調(diào),72小時后的表達量已接近對照組的3倍;而敏感細胞K562中僅輕度上調(diào)。最后WB檢測結(jié)果顯示白藜蘆醇沒有降低耐藥細胞P-gp的表達。
4.自噬抑制劑氯喹(CQ)抑制自噬可以降低K562/ADM細胞
7、對白藜蘆醇的敏感性,流式細胞儀檢測顯示經(jīng)CQ預處理后,K562/ADM細胞的凋亡率明顯下降,而K562細胞的凋亡率略有上升;WB檢測結(jié)果顯示經(jīng)CQ預處理后自噬標志蛋白 LC3、Beclin-1的表達較白藜蘆醇單獨作用組明顯下調(diào),凋亡相關(guān)蛋白caspase-3的活化降低,Bcl-2/Bax蛋白表達的比值升高。
結(jié)論:1.白藜蘆醇可誘導K562敏感細胞和K562/ADM耐藥細胞自噬活性,且K562/ADM細胞被誘導的自噬活性明顯高
8、于K562細胞。
2.白藜蘆醇通過增強K562/ADM耐藥細胞的自噬活性而誘導其凋亡,白藜蘆醇的細胞毒效應導致溶酶體膜通透性增加、Cath D釋放入胞質(zhì)、促進Bax介導的線粒體膜通透性與細胞色素c的釋放增多、激活Caspase級聯(lián)反應,最終導致細胞自噬性凋亡。白藜蘆醇同樣誘導K562敏感細胞自噬和凋亡,但自噬活化只是細胞凋亡的伴隨現(xiàn)象。
3. K562/ADM耐藥細胞的固有ROS水平顯著低于K562敏感細胞,且白藜蘆
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