STINg-IRF3信號通路介導血管和脂肪組織炎癥機制探索.pdf

1、研究背景:
　　血管并發(fā)癥是現在代謝綜合征病人的首要致死致殘因素。研究證明，內皮細胞作為維持血管結構和功能完整性的基本單元，其激活和炎癥狀態(tài)時血管并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的重要起始步驟。而代謝綜合征病人體內升高的代謝壓力正是引起內皮細胞激活的主要原因。但是迄今為止，內皮細胞激活/炎癥的具體機制仍然不明確，所以研究代謝應激下內皮細胞激活/炎癥的機制對于未來開發(fā)血管并發(fā)癥防治措施有重要意義。
　　多種遺傳或環(huán)境因素參與了代謝綜合征的發(fā)生發(fā)

2、展，內質網應激作為外界刺激的感受器和放大器，調節(jié)了細胞內的一系列信號通路的激活。生理情況下，細胞處于代謝穩(wěn)態(tài)，內質網伴侶蛋白Bip(Grp78)與ATF6、IRE1、PERK等激酶結合并抑制其活性。一旦給予細胞代謝壓力，UPR(Unfolded ProteinResponse)被激活，導致Bip與ATF6、IRE1、PERK等激酶脫離，進而引起下游一系列應激通路的激活。
　　線粒體作為細胞內的能量生成器，除了為機體合成ATP外，還

3、能夠調節(jié)細胞氧化還原和信號轉導。線粒體DNA(mtDNA)是位于線粒體內的含有37個線粒體基因的環(huán)狀DNA分子。由于mtDNA無內含子和組蛋白，而且容易暴露于高水平的活性氧環(huán)境下，所以mtDNA突變頻率較核基因組高10倍以上。而且一旦線粒體膜完整性受到破壞，mtDNA易被釋放入細胞漿，進而被DNA感受器識別，激活下游通路。
　　STING(stimulator of interferon genes， TMEM173)作為免疫和炎

4、癥中的一個重要信號分子，首先被認為是病毒感染過程中宿主免疫反應的重要分子。STING能夠識別病毒釋放到宿主胞漿內的DNA，從而招募TBK1(Tank-binding kinase1)和轉錄因子IRF3(interferon regulatory factor)形成復合物，并移位至細胞核周圍。在此過程中IRF3被TBK1磷酸化，形成二聚體結構并進入細胞核。進入細胞核的IRF3與目的基因（IFNα，IFNβ等）的啟動子結合，促進炎癥基因的表

5、達。近期有報告表明STING-IRF3信號通路能夠被內質網應激(ER stress)和線粒體損傷(mi tochondri al damage)激活，但其具體機制仍不明確。2014年新英格蘭雜志報道了一種發(fā)病于嬰兒期的STING相關血管病變(SAVI，STING-associated vasculopathy with onset ininfancy)，表現為STING過度激活伴隨內皮細胞炎癥。表明STING與內皮細胞炎癥之間存在關聯。

6、
　　研究目的:
　　研究STING-IRF3信號通路在棕櫚酸(palmitic acid，PA)誘導的內皮細胞炎癥中發(fā)揮的作用;闡明IRF3調節(jié)內皮細胞炎癥的分子機制;探討內質網應激和線粒體損傷/mtDNA在PA誘導STING-IRF3信號通路激活中的作用;活體實驗觀察STING-IRF3信號通路對代謝綜合征慢性炎癥的影響。
　　研究方法:
　　(1)棕櫚酸(PA)處理對內皮細胞炎癥的影響:將棕櫚酸融入20％牛

7、血清白蛋白(BSA)溶液后制成0-4mM的PA儲存液(10X)。使用細胞培養(yǎng)基ECM將PA儲存液稀釋至終濃度(0-0.4mM)后處理人主動脈內皮細胞相應時間，用于后續(xù)試驗。
　　(2)細胞轉染:下調細胞內相應基因表達時，使用lipofectamine2000或Jetprime試劑盒瞬時轉染siRNA6小時后給予后續(xù)處理。
　　(3)Western blot實驗:處理后細胞或速凍組織使用Western及IP細胞裂解液裂解，確定

8、蛋白濃度后高溫變性。使用SDS-PAGE膠進行凝膠電泳，免疫印跡檢測目的蛋白的表達水平。
　　(4)Real-time RT-PCR:處理后細胞使用TRIzol法提取總RNA，逆轉錄后進行實時定量PCR，檢測ICAM-1 mRNA表達水平的改變。
　　(5)免疫熒光顯微技術:細胞接種于含有細胞爬片的6孔板培養(yǎng)至相應細胞密度，給予指定處理后進行固定、封閉，然后依次加入一抗和二抗孵育，激光共聚焦顯微鏡觀察STING、IRF3等關

9、鍵分子在細胞內的定位情況。
　　(6)免疫共沉淀(Co-IP):未變性的全細胞裂解液去除非特異性結合后，加入STING或IRF3抗體過夜孵育后加入protein A+G agarose beads共同孵育，免疫沉淀產物變性后使用SDS-PAGE進行凝膠電泳，免疫印跡檢測Bip是否與STING存在生理學上的相互作用。
　　(7)染色質免疫共沉淀(Chip):細胞接種于10cm2細胞培養(yǎng)皿并給予相應處理后，使用1％多聚甲醛交聯后

10、給予SDS裂解，超聲粉碎，IRF3 pulldown和DNA提取后，進行實時定量PCR，比較IRF3與ICAM-1 promotor結合是否改變。
　　(8)動物模型:野生型小鼠和STING缺陷小鼠分別給予三個月高脂飲食后安樂死、取材。使用OCT包埋脂肪組織，切片，進行后續(xù)免疫熒光觀察。
　　(9)統計學分析:P＜0.05被認為差異有統計學意義。
　　研究結果:
　　1.棕櫚酸能夠引起內皮細胞炎癥激活:
　

11、　(1)使用Western blot檢測，梯度棕櫚酸PA處理人主動脈內皮細胞24小時能夠明顯增加內皮細胞黏附分子ICAM-1蛋白水平。
　　(2)梯度棕櫚酸PA處理人主動脈內皮細胞24小時能夠明顯上調磷酸化IRF3的水平。
　　(3)病理劑量的棕櫚酸PA處理人主動脈內皮細胞24小時能夠觀察到明顯的STING向細胞核周圍移動，并且伴隨IRF3移位至細胞核。
　　(4)梯度棕櫚酸PA處理人主動脈內皮細胞24小時能夠能夠明顯

12、增加內皮細胞與人單核細胞細胞系THP-1細胞的粘附。
　　(5)使用Real-time RT-PCR檢測結果顯示使用病理劑量的棕櫚酸PA處理人主動脈內皮細胞6小時后，黏附分子ICAM-1 mRNA水平升高約2.5倍。
　　2.下調STING蛋白水平對STING-IRF3信號通路和內皮細胞炎癥的影響:
　　(1) Western blot結果顯示下調STING表達可以顯著逆轉棕櫚酸誘導的IRF3磷酸化。
　　(2)

13、細胞免疫熒光結果顯示下調STING表達可顯著逆轉棕櫚酸誘導的IRF3移位。
　　(3) Western blot結果顯示下調STING表達可顯著下調棕櫚酸誘導的ICAM-1蛋白高表達。
　　(4) Real-time RT-PCRR結果顯示下調STING表達可顯著下調棕櫚酸誘導的ICAM-1 mRNA高表達。
　　(5)單核細胞粘附實驗結果表明下調STING表達可以顯著減少內皮細胞與單核細胞的粘附。
　　3.下調

14、轉錄因子IRF3蛋白水平對于內皮細胞炎癥的影響:
　　(1) Western blot實驗結果表明下調轉錄因子IRF3表達可顯著逆轉棕櫚酸誘導的ICAM-1蛋白水平升高。
　　(2) Real-time RT-PCR實驗結果表明下調IRF3表達能夠顯著逆轉棕櫚酸誘導的ICAM-1 mRNA水平升高
　　(3)分析ICAM-1基因啟動子結構，結果顯示ICAM-1基因啟動子內有IRF3的結合位點。
　　(4)染色質免

15、疫共沉淀實驗結果顯示棕櫚酸能夠誘導IRF3與ICAM--1啟動子結合明顯增加，下調STING蛋白水平可顯著逆轉IRF3與ICAM-1啟動子的結合。
　　(5)單核細胞粘附實驗結果表明下調IRF3蛋白水平能夠顯著逆轉棕櫚酸誘導的內皮細胞與單核細胞粘附。
　　4.內質網應激可能參與了棕櫚酸誘導的STING-IRF3通路激活:
　　(1) Western blot結果顯示棕櫚酸PA處理人主動脈內皮細胞能夠引起明顯的內質網應激

16、。
　　(2) Western blot結果同樣確認了內質網應激激活劑毒胡蘿卜素/DTT能夠引起明顯的內質網應激。
　　(3)細胞免疫熒光實驗表明DTT處理內皮細胞能夠引起明顯的STING核周移位和IRF3核移位。
　　(4) Western blot結果顯示毒胡蘿卜素/DTT處理內皮細胞能夠引起明顯的IRF3磷酸化和ICAM-1蛋白水平升高。
　　5.Bip-STING相互作用介導了棕櫚酸引起的STING-IR

17、F3信號通路激活:
　　(1)免疫共沉淀實驗表明正常內皮細胞內STING與Bip能夠相互結合。棕櫚酸、毒胡蘿卜素或DTT處理能夠減少兩者的相互結合。
　　(2)細胞免疫熒光實驗表明毒胡蘿卜素處理內皮細胞可以引起STING脫離內質網，并與EEA1或TFR陽性囊泡結合，移位至細胞核周圍。
　　(3)細胞免疫熒光實驗表明下調Bip表達能夠明顯促進STING向核周移位。
　　(4) Westernblot實驗結果顯示下調

18、Bip表達能夠明顯增加IRF3磷酸化及ICAM-1蛋白水平。
　　(5) Real Time RT-PCR結果確認下調Bip表達能夠明顯上調ICAM-1的mRNA水平。
　　6.線粒體損傷和線粒體DNA釋放對于STING-IRF3信號通路激活的影響:
　　(1)細胞免疫熒光實驗表明棕櫚酸處理內皮細胞后線粒體結構發(fā)生變化，胞漿內雙鏈DNA(dsDNA)明顯增加。
　　(2)使用Real Time RT-PCR實驗證

19、明，棕櫚酸處理內皮細胞后，可以引起胞漿內線粒體DNA數量顯著增加。
　　(3)免疫共沉淀實驗結果表明，使用線粒體DNA處理內皮細胞后能夠引起B(yǎng)ip-STING的結合減少。
　　(4)細胞免疫熒光實驗表明線粒體DNA處理內皮細胞后能夠引起STING核周移位及IRF3核移位。
　　(5) Western blot實驗結果表明給予內皮細胞線粒體DNA刺激，能夠引起IRF3磷酸化水平升高和ICAM-1蛋白水平升高。
　　

20、(6)免疫共沉淀實驗結果表明，使用線粒體損傷劑CCCP刺激細胞后，同樣能夠減少Bip-STING結合。
　　(7)細胞免疫熒光實驗表明給予內皮細胞線粒體損傷劑CCCP或rotenone后，STING、IRF3同樣出現明顯移位。
　　7.胞漿DNA識別蛋白cGAS可能在棕櫚酸誘導的內皮細胞中發(fā)揮作用。Western blot實驗結果表明，棕櫚酸能夠誘導內皮細胞cGAS(cGAMP合成酶)蛋白水平升高。同時下調cGAS表達能夠逆

21、轉棕櫚酸誘導的STING-IRF3信號通路激活和ICAM-1蛋白高表達。
　　8.在STING缺陷小鼠中證明STING-IRF3信號通路對于內皮細胞炎癥的影響:
　　(1) Western blot結果顯示高脂飲食能夠明顯上調脂肪組織內IRF3磷酸化水平和ICAM-1蛋白水平;而STING缺陷能夠逆轉高脂飲食引起的IRF3磷酸化和ICAM-1高表達。
　　(2)組織免疫熒光結果顯示高脂飲食能夠誘導小鼠脂肪組織血管內皮細

22、胞內ICAM-1表達明顯增加，而STING缺陷能夠顯著減少ICAM-1的表達。
　　(3)組織免疫熒光結果顯示高脂飲食能夠誘導小鼠脂肪組織血管內CD68+細胞浸潤增加，而STING缺陷能夠顯著減少CD68+細胞浸潤。
　　(4) HE染色結果顯示給予高脂飲食后小鼠脂肪組織中冠狀結構(crown likestructure)明顯增加，而STING缺陷后能夠顯著逆轉冠狀結構的數量。
　　(5) Masson染色結果顯色高脂

23、飲食能夠誘導小鼠脂肪組織膠原沉積增加，而STING缺陷能夠顯著改善膠原沉積。
　　(6) STING缺陷能夠改善高脂飲食引起的體重增加、游離脂肪酸水平升高和胰島素抵抗。
　　結論:
　　(1)棕櫚酸能夠通過激活STING-IRF3信號通路誘導內皮細胞炎癥。
　　(2)內質網應激和線粒體損傷/線粒體DNA釋放介導了棕櫚酸引起的STING-IRF3信號通路激活。
　　(3)內質網應激和線粒體損傷/線粒體DNA釋