MD2及其抑制劑L6H21在糖尿病并發(fā)癥中的研究.pdf

1、背景及目的：
　　糖尿病并發(fā)癥是當(dāng)今社會(huì)最難治愈的疾病之一，尤其是糖尿病腎病(DN)和心肌病(DCM)。雖然血糖控制作為糖尿病的治療手段之一已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，但是DN和DCM的發(fā)病率和致死率依然居高不下，嚴(yán)重威脅人們的健康。目前，DN和DCM的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但近年來(lái)炎癥學(xué)說(shuō)備受關(guān)注，該學(xué)說(shuō)認(rèn)為糖尿病并發(fā)癥是一種自然免疫和低度炎癥性疾病。炎癥學(xué)說(shuō)認(rèn)為炎癥反應(yīng)是DN和DCM發(fā)生發(fā)展的重要病理過(guò)程，高血糖的機(jī)體環(huán)境可以通過(guò)多

2、種途徑激活機(jī)體的炎癥反應(yīng)，包括器官自身的炎癥和血液中免疫細(xì)胞的炎癥;同時(shí)，自身炎癥能誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)，進(jìn)一步加劇炎癥過(guò)程。目前研究發(fā)現(xiàn)，常用的治療DN和DCM藥物有一定的抗炎作用，另外大量的流行病學(xué)、實(shí)驗(yàn)室以及臨床研究均已證實(shí)DN和DCM是一種炎癥相關(guān)疾病?？寡字委熡型蔀镈N和DCM治療的重要手段。
　　化合物L(fēng)6H21是我們課題組前期通過(guò)對(duì)查爾酮改造而合成的抗炎化合物。在前期的研究中，我們已經(jīng)通過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)證明L6H21能

3、顯著抑制LPS引起的炎癥通路MAPK/NF-KB的激活以及炎癥因子的釋放，能明顯緩解LPS引起的膿毒血癥。而在L6H21作用靶點(diǎn)尋找的實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)分子激酶、SPR等實(shí)驗(yàn)證實(shí)L6H21的靶點(diǎn)為MD2，繼而在細(xì)胞層面得到確診。以上實(shí)驗(yàn)都證明L6H21抗LPS引起的炎癥作用是通過(guò)抑制MD2產(chǎn)生的，最終確定L6H21的靶點(diǎn)為MD2。
　　本實(shí)驗(yàn)將基于L6H21的抗炎作用探討L6H21能否抑制高糖或高血糖的作用緩解DN和DCM;探討這一

4、抑制過(guò)程中涉及的機(jī)制;探討L6H21的靶點(diǎn)MD2在DCM中的作用;并評(píng)價(jià)MD2是否可以成為DCM的治療靶點(diǎn)。
　　(1)基于抗炎抗糖尿病的機(jī)理以及L6H21的基本抗炎活性，我們利用一型糖尿病模型（包括細(xì)胞和動(dòng)物模型）研究L6H21對(duì)糖尿病并發(fā)癥(DN和DCM)的治療作用。
　　(2)對(duì)L6H21抗炎效果的機(jī)制進(jìn)行研究探討，在抗炎活性篩選過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)L6H21能抑制LPS引起的MAPK和NF-KB通路的激活，抑制LPS刺激

5、的炎癥因子的分泌，但是在高糖環(huán)境下L6H21是否具有相同的作用仍然未知，并且除此之外L6H21是否還有其他作用值得我們進(jìn)一步探究。
　　(3)前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)得知L6H21的作用靶點(diǎn)是MD2，通過(guò)后續(xù)實(shí)驗(yàn)繼續(xù)深入研究MD2靶點(diǎn)在DN和DCM中的作用。
　　方法和結(jié)果：
　　(1)體外實(shí)驗(yàn)利用大鼠心肌細(xì)胞H9C2和大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E研究L6H21對(duì)高糖刺激的炎癥反應(yīng)（包括炎癥通路和炎癥因子）的影響，同時(shí)考察L6

6、H21對(duì)抗巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的效果。細(xì)胞給予L6H21(不同劑量2.5、5、10uM)預(yù)處理，然后用高糖(33mM)刺激不同時(shí)間，收集細(xì)胞和培養(yǎng)基，用ELISA、PCR、WB、IF等實(shí)驗(yàn)方法考察L6H21抗高糖刺激的效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明L6H21能劑量依賴的抑制高糖引起的炎癥因子的分泌和表達(dá)（TNF-a、IL-6、IL-beta等），同時(shí)L6H21也能劑量依賴的抑制高糖刺激的炎癥通路MAPK和NF-KB的激活（包括JNK、ERK、P38的磷酸化

7、;IKB的降解以及P65核轉(zhuǎn)移）。除此之外，我們也發(fā)現(xiàn)L6H21能抑制高糖引起的粘附因子（ICAM-1和VCAM-1）的表達(dá)和巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)。
　　(2)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)利用一型糖尿病小鼠模型，尿鏈佐菌素(STZ)誘導(dǎo)C57BL/6小鼠Ⅰ型糖尿病模型，以L6H21(10mg/kg)灌胃8周，檢測(cè)心臟和腎臟組織炎癥反應(yīng)（包括炎癥因子水平和炎癥通路情況）。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠體重和血糖監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)L6H21并不影響一型糖尿病小鼠的血糖和

8、體重，L6H21不具降血糖的效果;觀察H&E發(fā)現(xiàn)L6H21能明顯緩解高糖引起的心臟和腎臟結(jié)構(gòu)紊亂;同時(shí)Masson、Sirius Red等染色表明L6H21能降低心臟和腎臟的纖維化情況;并且用ELISA對(duì)血清心腎功能相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)，得出L6H21能較好緩解糖尿病引起的心腎損傷。我們也用PCR和WB以及免疫組化檢測(cè)得出L6H21能降低心腎炎癥因子（TNF-a和IL-6等）、粘附因子（ICAM-1和VCAM-1）的水平，能抑制MAPK和NF-

9、KB通路的激活，能減少巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)。本部分研究充分證明了L6H21通過(guò)MAPK和NF-KB抑制高糖引起的心腎炎癥反應(yīng)，緩解DN和DCM，并且伴隨組織巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的減少。
　　(3)在前面的研究中，我們以L6H21為工具藥初步得出MD2可能參與DCM的發(fā)生發(fā)展，為了進(jìn)一步研究MD2在DCM中的作用，確證MD2是否可成為糖尿病并發(fā)癥的治療靶點(diǎn)。這部分實(shí)驗(yàn)以DCM為模型探討MD2在DCM中的作用。體外實(shí)驗(yàn)利用MD2中和抗體和小干擾RN

10、A抑制沉默大鼠心肌細(xì)胞H9C2中的MD2以及利用MD2沉默的巨噬細(xì)胞，通過(guò)ELISA、PCR、WB、IF等實(shí)驗(yàn)方法考察抑制MD2對(duì)高糖刺激作用的影響;同時(shí)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)利用MD2敲除小鼠和相同背景的B6小鼠研究MD2在一型糖尿病小鼠中的角色，STZ誘導(dǎo)一型糖尿病小鼠8周，研究MD2敲除對(duì)糖尿病小鼠心臟組織炎癥、纖維化和功能的影響。
　　結(jié)論：
　　L6H21能抑制高糖引起的炎癥通路MAPK/NF-KB的激活，抑制心肌細(xì)胞和腎上皮細(xì)

11、胞炎癥因子和粘附因子的分泌，減輕糖尿病小鼠心臟和腎臟組織中的炎癥并伴隨巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的減少，改善心臟和腎臟的纖維化，緩解糖尿病引起的心臟和腎臟損傷。
　　L6H21的作用靶點(diǎn)MD2在DCM起重要促進(jìn)作用。研究發(fā)現(xiàn)MD2抑制能顯著抑制H9C2細(xì)胞高糖引起的炎癥通路MAPK/NF-KB的激活，炎癥因子和粘附因子的分泌;并且MD2敲除糖尿病小鼠的病理發(fā)展明顯比普通糖尿病小鼠慢，心肌的炎癥，纖維化以及凋亡比普通糖尿病小鼠輕，MD2可以成為D