MD2及其抑制劑L6H21在糖尿病并發(fā)癥中的研究.pdf

1、背景及目的：
　　糖尿病并發(fā)癥是當(dāng)今社會最難治愈的疾病之一，尤其是糖尿病腎病(DN)和心肌病(DCM)。雖然血糖控制作為糖尿病的治療手段之一已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，但是DN和DCM的發(fā)病率和致死率依然居高不下，嚴重威脅人們的健康。目前，DN和DCM的病因和發(fā)病機制尚未完全闡明，但近年來炎癥學(xué)說備受關(guān)注，該學(xué)說認為糖尿病并發(fā)癥是一種自然免疫和低度炎癥性疾病。炎癥學(xué)說認為炎癥反應(yīng)是DN和DCM發(fā)生發(fā)展的重要病理過程，高血糖的機體環(huán)境可以通過多

2、種途徑激活機體的炎癥反應(yīng)，包括器官自身的炎癥和血液中免疫細胞的炎癥;同時，自身炎癥能誘導(dǎo)免疫細胞的浸潤，進一步加劇炎癥過程。目前研究發(fā)現(xiàn)，常用的治療DN和DCM藥物有一定的抗炎作用，另外大量的流行病學(xué)、實驗室以及臨床研究均已證實DN和DCM是一種炎癥相關(guān)疾病?？寡字委熡型蔀镈N和DCM治療的重要手段。
　　化合物L(fēng)6H21是我們課題組前期通過對查爾酮改造而合成的抗炎化合物。在前期的研究中，我們已經(jīng)通過一系列的實驗證明L6H21能

3、顯著抑制LPS引起的炎癥通路MAPK/NF-KB的激活以及炎癥因子的釋放，能明顯緩解LPS引起的膿毒血癥。而在L6H21作用靶點尋找的實驗中，我們通過分子激酶、SPR等實驗證實L6H21的靶點為MD2，繼而在細胞層面得到確診。以上實驗都證明L6H21抗LPS引起的炎癥作用是通過抑制MD2產(chǎn)生的，最終確定L6H21的靶點為MD2。
　　本實驗將基于L6H21的抗炎作用探討L6H21能否抑制高糖或高血糖的作用緩解DN和DCM;探討這一

4、抑制過程中涉及的機制;探討L6H21的靶點MD2在DCM中的作用;并評價MD2是否可以成為DCM的治療靶點。
　　(1)基于抗炎抗糖尿病的機理以及L6H21的基本抗炎活性，我們利用一型糖尿病模型（包括細胞和動物模型）研究L6H21對糖尿病并發(fā)癥(DN和DCM)的治療作用。
　　(2)對L6H21抗炎效果的機制進行研究探討，在抗炎活性篩選過程中，我們發(fā)現(xiàn)L6H21能抑制LPS引起的MAPK和NF-KB通路的激活，抑制LPS刺激

5、的炎癥因子的分泌，但是在高糖環(huán)境下L6H21是否具有相同的作用仍然未知，并且除此之外L6H21是否還有其他作用值得我們進一步探究。
　　(3)前期實驗已經(jīng)得知L6H21的作用靶點是MD2，通過后續(xù)實驗繼續(xù)深入研究MD2靶點在DN和DCM中的作用。
　　方法和結(jié)果：
　　(1)體外實驗利用大鼠心肌細胞H9C2和大鼠腎小管上皮細胞NRK-52E研究L6H21對高糖刺激的炎癥反應(yīng)（包括炎癥通路和炎癥因子）的影響，同時考察L6

6、H21對抗巨噬細胞浸潤的效果。細胞給予L6H21(不同劑量2.5、5、10uM)預(yù)處理，然后用高糖(33mM)刺激不同時間，收集細胞和培養(yǎng)基，用ELISA、PCR、WB、IF等實驗方法考察L6H21抗高糖刺激的效果。實驗結(jié)果表明L6H21能劑量依賴的抑制高糖引起的炎癥因子的分泌和表達（TNF-a、IL-6、IL-beta等），同時L6H21也能劑量依賴的抑制高糖刺激的炎癥通路MAPK和NF-KB的激活（包括JNK、ERK、P38的磷酸化

7、;IKB的降解以及P65核轉(zhuǎn)移）。除此之外，我們也發(fā)現(xiàn)L6H21能抑制高糖引起的粘附因子（ICAM-1和VCAM-1）的表達和巨噬細胞的浸潤。
　　(2)體內(nèi)實驗利用一型糖尿病小鼠模型，尿鏈佐菌素(STZ)誘導(dǎo)C57BL/6小鼠Ⅰ型糖尿病模型，以L6H21(10mg/kg)灌胃8周，檢測心臟和腎臟組織炎癥反應(yīng)（包括炎癥因子水平和炎癥通路情況）。在整個實驗過程中，對實驗小鼠體重和血糖監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)L6H21并不影響一型糖尿病小鼠的血糖和

8、體重，L6H21不具降血糖的效果;觀察H&E發(fā)現(xiàn)L6H21能明顯緩解高糖引起的心臟和腎臟結(jié)構(gòu)紊亂;同時Masson、Sirius Red等染色表明L6H21能降低心臟和腎臟的纖維化情況;并且用ELISA對血清心腎功能相關(guān)指標(biāo)檢測，得出L6H21能較好緩解糖尿病引起的心腎損傷。我們也用PCR和WB以及免疫組化檢測得出L6H21能降低心腎炎癥因子（TNF-a和IL-6等）、粘附因子（ICAM-1和VCAM-1）的水平，能抑制MAPK和NF-

9、KB通路的激活，能減少巨噬細胞的浸潤。本部分研究充分證明了L6H21通過MAPK和NF-KB抑制高糖引起的心腎炎癥反應(yīng)，緩解DN和DCM，并且伴隨組織巨噬細胞浸潤的減少。
　　(3)在前面的研究中，我們以L6H21為工具藥初步得出MD2可能參與DCM的發(fā)生發(fā)展，為了進一步研究MD2在DCM中的作用，確證MD2是否可成為糖尿病并發(fā)癥的治療靶點。這部分實驗以DCM為模型探討MD2在DCM中的作用。體外實驗利用MD2中和抗體和小干擾RN

10、A抑制沉默大鼠心肌細胞H9C2中的MD2以及利用MD2沉默的巨噬細胞，通過ELISA、PCR、WB、IF等實驗方法考察抑制MD2對高糖刺激作用的影響;同時體內(nèi)實驗利用MD2敲除小鼠和相同背景的B6小鼠研究MD2在一型糖尿病小鼠中的角色，STZ誘導(dǎo)一型糖尿病小鼠8周，研究MD2敲除對糖尿病小鼠心臟組織炎癥、纖維化和功能的影響。
　　結(jié)論：
　　L6H21能抑制高糖引起的炎癥通路MAPK/NF-KB的激活，抑制心肌細胞和腎上皮細

11、胞炎癥因子和粘附因子的分泌，減輕糖尿病小鼠心臟和腎臟組織中的炎癥并伴隨巨噬細胞浸潤的減少，改善心臟和腎臟的纖維化，緩解糖尿病引起的心臟和腎臟損傷。
　　L6H21的作用靶點MD2在DCM起重要促進作用。研究發(fā)現(xiàn)MD2抑制能顯著抑制H9C2細胞高糖引起的炎癥通路MAPK/NF-KB的激活，炎癥因子和粘附因子的分泌;并且MD2敲除糖尿病小鼠的病理發(fā)展明顯比普通糖尿病小鼠慢，心肌的炎癥，纖維化以及凋亡比普通糖尿病小鼠輕，MD2可以成為D