青蒿琥酯通過影響神經(jīng)酰胺從頭合成途徑的限速酶SPT抑制肝纖維發(fā)生的作用.pdf

1、目的：
　　研究青蒿琥酯對(duì)肝星狀細(xì)胞株LX-2細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺從頭合成途徑的限速酶SPT及神經(jīng)酰胺水平的影響，揭示其促進(jìn)神經(jīng)酰胺從頭合成的抑制肝纖維發(fā)生的作用機(jī)制，為青蒿琥酯應(yīng)用于肝纖維化的臨床防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1、以體外培養(yǎng)人源肝星狀細(xì)胞（HSCs）株LX-2為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，將其分為細(xì)胞對(duì)照組、青蒿琥酯（Art）給藥組、神經(jīng)酰胺C2(C2-ceramide, C2)給藥組、青蒿琥酯與神經(jīng)酰胺C2合用組。采

2、用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法分析LX-2細(xì)胞的增殖情況；應(yīng)用高效液相色譜HPLC-FLD法測定LX-2細(xì)胞培養(yǎng)上清中神經(jīng)酰胺C2的水平；采用Western Blot法檢測LX-2細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白bax、bcl-2及caspase-3的表達(dá)水平；應(yīng)用比色法檢測細(xì)胞上清液中乳酸脫氫酶（LDH）的活性，以分析青蒿琥酯及神經(jīng)酰胺C2對(duì)LX-2的細(xì)胞毒性；利用酶消化法檢測LX-2細(xì)胞上清液中的羥脯氨酸（Hyp）含量，評(píng)價(jià)青蒿琥酯抑制肝纖維發(fā)生的

3、作用。
　　2、將 LX-2細(xì)胞分為細(xì)胞對(duì)照組、青蒿琥酯給藥組、絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑—多球殼菌素（myriocin）給藥組、青蒿琥酯與多球殼菌素合用組。Western Blot法檢測LX-2細(xì)胞內(nèi)絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1（SPTLC1）和2（SPTLC2）的表達(dá)水平，并用HPLC-FLD法檢測其上清液中神經(jīng)酰胺C2含量，對(duì)青蒿琥酯影響LX-2細(xì)胞內(nèi)的神經(jīng)酰胺從頭合成途徑加以證實(shí)；同時(shí)，分別如上述方法檢測LX-2細(xì)胞增殖，細(xì)胞內(nèi)ba

4、x、bcl-2及caspase-3蛋白表達(dá)，上清液中Hyp的含量。
　　結(jié)果：
　　1、青蒿琥酯提高了 LX-2細(xì)胞中神經(jīng)酰胺的水平及其作用：與細(xì)胞對(duì)照組比較得出，青蒿琥酯可顯著抑制LX-2的細(xì)胞增殖，且其增殖抑制作用呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；青蒿琥酯給藥組細(xì)胞上清中神經(jīng)酰胺含量均明顯增加（P<0.05）；同時(shí)，青蒿琥酯可上調(diào) LX-2細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白 bax與 caspase-3的表達(dá)，下調(diào) bcl-

5、2蛋白的表達(dá)，使 bax/bcl-2比值增大（P<0.05）；青蒿琥酯組LDH活性與對(duì)照組比較無顯著性差異（P>0.05）；青蒿琥酯各劑量作用于LX-2細(xì)胞24 h后，細(xì)胞上清液中Hyp的含量明顯減少，且Hyp含量隨著青蒿琥酯劑量的增大而逐漸下降（P<0.05）。C2可抑制LX-2的細(xì)胞增殖（P<0.05），且其抑制作用呈劑量依賴性；隨著 C2濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)bax與caspase-3蛋白表達(dá)增多，bcl-2蛋白表達(dá)減少，使bax/b

6、cl-2比值增大，差異具有顯著性意義；但各組間 LDH活性的差異均無顯著性意義（P>0.05）；C2可呈劑量依賴性地顯著降低LX-2細(xì)胞上清液中的Hyp含量（P<0.05）。
　　2、青蒿琥酯增加了LX-2細(xì)胞內(nèi)絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1和2的表達(dá)及其作用：與細(xì)胞對(duì)照組比較得出，15μmol/L多球殼菌素處理LX-2細(xì)胞24h時(shí)后細(xì)胞呈明顯的增殖狀態(tài)（P<0.05）；青蒿琥酯給藥組的 LX-2細(xì)胞中神經(jīng)酰胺從頭合成途徑的限速酶 SPTL

7、C1和 SPTLC2蛋白表達(dá)增多，細(xì)胞上清液中神經(jīng)酰胺含量增加，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而 SPT特異性抑制劑多球殼菌素可減少LX-2細(xì)胞表達(dá)SPTLC1和SPTLC2蛋白（P<0.05），同時(shí)，細(xì)胞上清液中神經(jīng)酰胺的含量也降低（P<0.05）；15μmol/L多球殼菌素分別與250、350、450μmol/L青蒿琥酯合用后，可減弱青蒿琥酯對(duì)LX-2細(xì)胞的增殖抑制作用，而且降低青蒿琥酯上調(diào)SPTLC1、SPTLC2蛋白表達(dá)及神經(jīng)酰胺水平

8、的作用（P<0.05）；與青蒿琥酯單獨(dú)用藥比較，合用15μmol/L多球殼菌素后可減弱青蒿琥酯上調(diào)bax、caspase-3及下調(diào)bcl-2蛋白表達(dá)的能力，同時(shí)降低了青蒿琥酯降低LX-2上清液中羥脯氨酸的作用，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1、青蒿琥酯可通過增加神經(jīng)酰胺從頭合成途徑的限速酶SPT的表達(dá)，提高細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺的水平。
　　2、青蒿琥酯通過提高 LX-2細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺的含量，一方面呈劑量和時(shí)間依賴性地