腎上腺皮質(zhì)癌中新型分子靶點的篩選及其意義.pdf

1、第一部分：類固醇生長因子-1和血管內(nèi)皮生長因子在腎上腺皮質(zhì)癌中的表達及其與血管生成的關(guān)系
　　目的：
　　腎上腺皮質(zhì)癌（adrenocortical carcinoma，ACC）是一種較少見的腎上腺皮質(zhì)細胞來源的具有內(nèi)分泌功能的惡性腫瘤，該腫瘤預(yù)后普遍不佳。而腫瘤相關(guān)性血管生成與腫瘤進展過程密切相關(guān)，并且參與了腫瘤遠處轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，V

2、EGF）是一種具有高效能的促血管形成的糖蛋白，其在重塑細胞外基質(zhì)、生成炎癥因子、生成造血干細胞等方面發(fā)揮相當(dāng)重要的作用，進而與內(nèi)皮細胞生長增殖以及遷移等行為具有相關(guān)性。而類固醇生成因子1（steroidogenic factor-1，SF-1）是一種核受體轉(zhuǎn)錄因子，可通過與血管生成素2（Angiopoietin2，Ang2）的相互作用，進而與酪氨酸激酶受體Tie2間接發(fā)生功能上的連接，后者可調(diào)節(jié)VEGF的功能，從而調(diào)整新生血管形成的全過

3、程。我們通過翻閱各種不同的文獻，發(fā)現(xiàn)上述兩種指標(biāo)在腎上腺皮質(zhì)癌中研究并不多，本實驗通過免疫組織化學(xué)及形態(tài)學(xué)定量分析，對良性腎上腺皮質(zhì)腺瘤以及ACC患者腫瘤標(biāo)本中上述兩者的染色情況進行分析，同時采用CD34特異性標(biāo)記血管內(nèi)皮細胞，從而檢測微血管密度（microvessel density，MVD）的染色情況，同時結(jié)合既往病歷資料，從而探討VEGF、SF-1在腎上腺腫瘤進展及新生血管生成過程中的意義。
　　方法：
　　1、選取住

4、院時間處于1990年5月-2012年7月，在上海瑞金醫(yī)院手術(shù)切除腫瘤，同時具有完整臨床、病理數(shù)據(jù)的腎上腺皮質(zhì)腫瘤石蠟標(biāo)本共52例。將其依據(jù)腫瘤性質(zhì)分為腎上腺皮質(zhì)腺瘤組（良性組）25例，腎上腺皮質(zhì)癌組（惡性組）27例。
　　2、采用免疫組化技術(shù)，對良、惡性組中SF-1、VEGF相關(guān)指標(biāo)的表達情況進行檢測與分析。并采用半定量積分計數(shù)法對腫瘤性質(zhì)進行加權(quán)評分。對細胞染色特征的判定主要來源于細胞內(nèi)的染色顆粒情況與陽性染色所占比例兩種指標(biāo)進

5、行加權(quán)。兩者之和處于0-2分之間判定為染色陰性（-），3分為一般陽性（+），4分為中度陽性（++），5-6分為染色強陽性（+++）。腫瘤內(nèi)MVD計數(shù)：首先在低倍物鏡（x40）下隨機選取高血管密度區(qū)，隨后在高倍鏡(x400)下隨機選用并計數(shù)3個視野內(nèi)被CD34陽性染色的血管數(shù)，分析并計算上述的平均值作為MVD值（微血管數(shù)/視野）。3、分析并對比良、惡性組間SF-1、VEGF指標(biāo)的表達情況及MVD的區(qū)別。
　　結(jié)果：
　　1、S

6、F-1在ACC組中呈高表達(20/27，74.07％)，在良性腎上腺腺瘤組表達低(7/25，28.00%)，兩組之間SF-1的表達率有顯著性差別（P<0.05）。VEGF在ACC組中呈高表達(19/27，70.37%)，在良性組中表達較低（8/25，32.00%），VEGF在兩組之間的表達情況有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　2、微血管密度（MVD）在ACC組中的表達為(69.22±22.56)/視野，良性組中為(27.76±1

7、2.75)/視野，兩者之間有顯著性差異（P<0.05）
　　2、3、Spearman等級相關(guān)分析結(jié)果提示，SF-1的表達和MVD呈正相關(guān)（r，s=0.856，P<0.0001），VEGF的表達和MVD呈正相關(guān)（r，s=0.764，P<0.0001），提示在ACC患者的腫瘤新生血管形成的過程中可能涉及了SF-1、VEGF的作用。
　　結(jié)論：
　　腎上腺皮質(zhì)癌組織中SF-1、VEGF的表達要高于良性腎上腺皮質(zhì)腺瘤，同時SF

8、-1、VEGF的表達情況分別與MVD有一定的正相關(guān)，提示上述兩種指標(biāo)均可能與ACC腫瘤相關(guān)血管形成有關(guān)。
　　第二部分：胰島素類似物生長因子1受體基因沉默對人腎上腺皮質(zhì)癌細胞株SW13增殖凋亡的影響
　　目的：通過構(gòu)建特定的小干擾RNA特異性沉默胰島素類似物生長因子1受體（IGF1R）基因，檢測人類腎上腺皮質(zhì)癌細胞株SW13增殖及凋亡在受體沉默后的變化情況，探討IGF1R在腎上腺皮質(zhì)癌中的意義，從而為人類腎上腺皮質(zhì)癌的靶向治

9、療提供依據(jù)。方法：使用免疫熒光技術(shù)對人類腎上腺皮質(zhì)癌細胞系SW13中IGF1R蛋白的表達進行定性分析。同時依據(jù)人類IGF1R的cDNA序列合成其蛋白特異性SiRNA，通過脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)染SW13細胞，從而特異性沉默IGF1R基因，然后在轉(zhuǎn)染后24小時后通過實時定量Realtime PCR檢測SiRNA對靶基因mRNA的沉默作用，并且使用western blot檢測其靶蛋白的表達情況，分析SiRNA對IGF1R的沉默效率。篩選出干擾效率最高

10、的SiRNA，再通過MTT法測定轉(zhuǎn)染后細胞增殖活性，流式細胞儀測定細胞凋亡狀態(tài)，并進行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　1、免疫熒光實驗證實人腎上腺皮質(zhì)癌細胞SW13中可見IGF1R的陽性表達；
　　2、3種不同的針對IGF1R的SiRNA序列均能夠有效下調(diào)SW13細胞IGF1R mRNA水平，而通過western blot檢測也發(fā)現(xiàn)在蛋白水平出現(xiàn)IGF1R蛋白的表達減低。從中篩選出沉默效率最高的SiRNA-2403；