隆線溞孤雌溞cDNA文庫的構建及Chemonsensory基因的研究.pdf

1、枝角類又稱水蚤,是一類在淡水中普遍存在的小型浮游動物,隸屬于節(jié)肢動物門,甲殼綱。是魚類和無脊椎動物的開口餌料,在水生態(tài)系統(tǒng)中有重要的作用;同時由于它們能夠指示環(huán)境中的有毒物質(zhì),并具有易于培養(yǎng)、生活周期短等特點,因此被廣泛地應用于形態(tài)學,種群生態(tài)學,種質(zhì)遺傳學,環(huán)境評估及毒理學等研究領域。水蚤的生殖方式十分特殊,它們具有兩種生殖模式。當環(huán)境條件適宜的時候,以孤雌生殖（卵子不經(jīng)受精而直接發(fā)育成子代的生殖方式）為主,然而當受到諸如溫度改變,食

2、物匱乏,種群密度過大等環(huán)境脅迫因素時,生殖方式即會轉(zhuǎn)為兩性生殖。因此,由于其性別決定和環(huán)境可誘導性別轉(zhuǎn)化的特殊性,使蚤類成為生殖轉(zhuǎn)化研究的良好模式動物。但大多研究集中于環(huán)境因子對生殖影響方面,從分子生物學角度探討生殖發(fā)育規(guī)律十分有限。表達序列標簽（包含在cDNA文庫中的序列）分析技術是一項在組織細胞中能夠有效鑒別新基因和測量基因表達譜的方法。目前已經(jīng)廣泛的應用于新基因的發(fā)現(xiàn)、基因組物理圖譜的構建、基因組中基因的預測、轉(zhuǎn)錄模式的確定、單核

3、苷酸多態(tài)性的發(fā)現(xiàn)和分子標記的建立等研究中。本文以淡水水域常見種—隆線溞[Daphnia（Ctenodaphnia） carinata]孤雌溞成體為研究對象,運用分子生物學技術構建其cDNA文庫,采用生物信息學手段對文庫數(shù)據(jù)進行分析并構建基因表達譜。從文庫中篩選出功能注釋為Chemosensory蛋白的片段,通過分子生物學實驗獲得其部分序列。運用分子生物學、毒理學以及透射電鏡等技術在不同環(huán)境條件刺激下,分析該蛋白表達差異和對隆線溞生長和生

4、殖的影響。旨在探索枝角類生殖轉(zhuǎn)化的規(guī)律和分子基礎,拓展和豐富甲殼動物發(fā)育生物學的研究內(nèi)容,促進枝角類生殖生物學研究的深入和發(fā)展,同時為實現(xiàn)枝角類生殖轉(zhuǎn)化的人為調(diào)控奠定基礎。本論文主要研究結果與結論如下:1.隆線溞孤雌溞cDNA文庫的構建、EST序列分析以及與大型溞基因組數(shù)據(jù)庫的比對研究首次構建了隆線溞孤雌溞成體的cDNA文庫,并從中隨機選取3072個克隆進行測序,最終得到3040個ESTs,平均長度571bp。去除載體和低質(zhì)量序列后得到

5、2997個高質(zhì)量EST序列（GenBank accession no.:GD269049-GD272045）,平均長度為617bp。2997個序列經(jīng)拼接聚類后得到了465條contigs和1030條singletons,因此最終得到的unique sequences為1495條。通過BLASTX和BLASTN程序分別與非冗余蛋白和核酸數(shù)據(jù)庫進行序列同源性比對。E-value低于1.0×10-5認為序列顯著性同源。有959條uniques

6、equences（64％）與已知基因有較高同源性。經(jīng)功能注釋與分類后,發(fā)現(xiàn)了一些與水溞生殖發(fā)育以及環(huán)境感應相關的新基因。該文庫與報道的大型溞全基因組數(shù)據(jù)庫比較,結果顯示,1495個uniquesequences中有1283條（86%）序列與大型溞基因組序列可匹配成功。2.不同環(huán)境因子對隆線溞生長和生殖的影響以及Chemonsensory基因的表達差異通過環(huán)境因子誘導,觀測分析隆線溞各相關生理生化指標的變化,探討環(huán)境因子對隆線溞生殖轉(zhuǎn)化的

7、的影響以及環(huán)境感應蛋白在其應激過程中表達量的變化及作用。2.1環(huán)境因子對隆線溞生長發(fā)育和生殖的影響通過單因子梯度試驗方法,研究了添加不同濃度CdCl2（0.32,0.56,1.00,1.80,3.20,5.60,10.00,18.00,32.00μg/L）以及改變溫度（高溫32℃,低溫6℃）對隆線溞體長、第一次懷卵日、懷卵數(shù)的影響以及CdCl2對隆線溞腸壁超微結構的損傷。溫度及重金屬離子對隆線漢溞的生殖發(fā)育都有較大影響:Cd2+對隆線溞

8、24h,48h,72h,96h的LC50分別為1800,560,282,132.1μg/L。9個安全濃度處理隆線溞一個生殖周期后,在Cd2+的干擾下,與對照組相比,隆線溞在低濃度下體長有所增加,在較高濃度下,體長表現(xiàn)出明顯的下降趨勢;Cd2+使其懷卵日提前,皆有早熟趨勢。懷卵數(shù)在低濃度下變化不大,高濃度下急劇減少,但孵化率受其影響不明顯。隆線溞腸壁細胞超微結構的損傷程度隨著鎘濃度的升高而明顯加劇。與對照組相比,高溫對隆線溞的生長無明顯促

9、進作用,但會提早性成熟時間;低溫不但會抑制其生長,對生殖也有抑制作用,且低溫對其生長發(fā)育的影響強于高溫。本研究結果可為漁業(yè)水質(zhì)標準和工業(yè)廢水排放標準制定提供理論支持,同時可為水生動物生態(tài)毒理學的研究積累基礎資料。2.2不同環(huán)境因子影響下Chemonsensory基因的表達的差異環(huán)境感應蛋白屬于一類保守的蛋白家族,對環(huán)境因子的變化敏感。在本實驗所設高溫,低溫以及不同濃度CdCl2處理等環(huán)境因子誘導下,與內(nèi)參基因（核糖體L8）相比,環(huán)境感應

10、蛋白的表達量除高溫組均有不同幅度升高。高溫可使Chemonsensory2和Chemonsensory3的相對表達量稍稍降低,低溫可使Chemonsensory2和Chemonsensory3的相對表達量大幅度升高。兩種環(huán)境感應蛋白的相對表達量都會隨著CdCl2濃度的升高而升高。兩種蛋白各自在孤雌溞和兩性種體內(nèi)的相對表達量相同。Chemonsensory3的表達水平總體高于Chemonsensory2。這表明環(huán)境感應蛋白在不良環(huán)境脅迫下