幽門螺桿菌粘膜核酸疫苗的制備及免疫學(xué)效應(yīng)研究.pdf

1、目的： 幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，Hp)在人群中呈現(xiàn)高感染率，嚴(yán)重危害人類健康。用Hp核酸疫苗預(yù)防Hp感染的報(bào)道不多，且效果不甚理想。本研究擬構(gòu)建殼聚糖包裹的Hp粘膜核酸疫苗，采用與抗原共表達(dá)細(xì)胞因子的方式來(lái)增強(qiáng)和調(diào)控免疫反應(yīng)，同時(shí)觀察疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答與抗Hp定植之間的關(guān)系，進(jìn)一步揭示疫苗可能的保護(hù)性機(jī)制。 方法： 1.以Hp標(biāo)準(zhǔn)株NCTC11637基因組為模板，PCR擴(kuò)增hpaA及ur

2、eB基因，亞克隆至pMD18-T載體，酶切并測(cè)序鑒定后，克隆至真核表達(dá)載體pTCAE，構(gòu)建pT-H和pT-U，并分別轉(zhuǎn)化DH5α。抽提質(zhì)粒電穿孔法轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，間接免疫熒光法及免疫印跡法檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。分別將pT-H、pT-U注射小鼠股四頭肌，檢測(cè)血清中特異性IgG水平。 2.RT-PCR法從小鼠脾臟中擴(kuò)增GM-CSF、IL4基因，亞克隆至pMD18-T載體，酶切并測(cè)序鑒定后，將細(xì)胞因子基因分別插入pT-U中，構(gòu)建真核表達(dá)

3、載體pT-GU、pT-IU。抽提質(zhì)粒電穿孔法轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，免疫印跡法檢測(cè)GM-CSF、IL4的表達(dá)，并通過(guò)細(xì)胞因子依賴細(xì)胞測(cè)活。 3.發(fā)酵工程菌DH5α(pT-U)，采用裂菌——QSepharoseXL粗純化——Source30Q精細(xì)純化的方法純化質(zhì)粒。經(jīng)復(fù)合物凝聚法制備、比較不同濃度殼聚糖和質(zhì)粒形成納米粒子的形狀、大小、穩(wěn)定性，確定適合的濃度搭配。 4.發(fā)酵工程菌，純化pT、pT-GU、pT-IU，并制備殼聚糖包裹的

4、納米粒子。將裸質(zhì)粒pT-U和殼聚糖包裹的pT、pT-U、pT-GU、pT-IU分別滴鼻或口服免疫BALB/c小鼠，測(cè)定小鼠血清特異性IgG、IgG1、IgG2a、IgA、糞便抽提物的sIgA，胃組織RT-PCR檢測(cè)GAPDH、IFN-γ、IL10、mBD1、mBD3的表達(dá)水平。將殼聚糖包裹的pT、pT-U、pT-GU、pT-IU分別滴鼻或口服免疫沙鼠，末次免疫后2周灌喂109CFUHp動(dòng)物適應(yīng)株，4周后檢測(cè)Hp定植情況。 結(jié)果：

5、 1.構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pT-H和pT-U，電穿孔轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，證實(shí)能夠表達(dá)目的蛋白HpaA和UreB。肌注免疫BALB/c小鼠后，血清特異性IgG水平表明，pT-U比pT-H能誘導(dǎo)更高的抗體水平，且差異非常顯著(p＜0.01)。 2.構(gòu)建了pT-GU和pT-IU，電穿孔轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，證實(shí)能夠表達(dá)目的蛋白GM-CSF和IL4，且分別能夠維持相應(yīng)的細(xì)胞因子依賴細(xì)胞的生長(zhǎng)。 3.通過(guò)發(fā)酵和純化獲得了高純度的質(zhì)粒p

6、T-U。確定制備納米微粒時(shí)，殼聚糖和質(zhì)粒的較佳濃度分別為0.2％和200μg/mL。 4.裸質(zhì)粒pT-U口服或滴鼻免疫不能誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答。經(jīng)鼻免疫各組誘導(dǎo)的抗體均高于口服免疫組；當(dāng)免疫途徑相同時(shí)，血清抗體水平及糞便抽提物中sIgA水平為：Ch-pT-IU＞Ch-pT-GU＞Ch-pT-U；血清IgG亞類檢測(cè)表明Ch-pT-GU、Ch-pT-U免疫后，IgG2a明顯增高，Ch-pT-GU尤為明顯，Ch-pT-IU免疫后，IgG

7、1明顯增高。胃組織的RT-PCR檢測(cè)表明，β-免疫防御素的表達(dá)增高和載體有關(guān)，GM-CSF能促進(jìn)其表達(dá)。各免疫組IFN-γ均有增高，其中Ch-pT-GU增加最為顯著(p＜0.01)，Ch-pT-IU免疫組IL10表達(dá)明顯增高，與其余組比較相差非常顯著(p＜0.01)。 5.口服免疫組中，Ch-pT、Ch-pT-U、Ch-pT-GU、Ch-pT-IU免疫組的保護(hù)率為13.3％、20.0％、40.0％、60.0％。滴鼻免疫組中，Ch

8、-pT、Ch-pT-U、Ch-pT-GU、Ch-pT-IU免疫組的保護(hù)率為14.3％、33.3％、57.1％、71.4％。 結(jié)論： 1.肌肉注射免疫時(shí)，pT-U比pT-H能誘導(dǎo)更高的特異性抗體，且相差非常顯著(p＜0.01)； 2.通過(guò)發(fā)酵和堿裂解法破菌、陰離子交換柱純化質(zhì)粒的方法，能夠大量獲得滿足實(shí)驗(yàn)要求的質(zhì)粒； 3.采用復(fù)合物凝聚方法制備納米核酸疫苗較佳濃度為：殼聚糖濃度為0.2％，質(zhì)粒濃度為200μ