唑來膦酸對破骨細胞分化中鈣調(diào)蛋白、鈣調(diào)磷酸酶表達的影響.pdf

1、目的：本研究旨在探討在唑來膦酸對破骨細胞分化中參與鈣信號傳遞的兩個關(guān)鍵分子-Calmodulin和Calcineurin基因表達的影響，探討它們在唑來膦酸誘發(fā)的破骨細胞分化抑制中的作用。
　　方法：本實驗首先建立了RAW264.7小鼠單核巨噬細胞株培養(yǎng)體系，用濃度為100ng/ml的RANKL（Ligand of receptor activator of nuclear factorκB）誘導RAW264.7破骨細胞向分化。將細

2、胞分為A、B兩組，兩組細胞均用RANKL誘導4天，而B組的細胞在第二天加入1×10-6M唑來膦酸處理48小時，4天后收獲細胞。通過以下檢測方法，研究唑來膦酸對破骨細胞分化中 Calmodulin和Calcineurin基因表達以及破骨細胞生成的影響：1抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色和牙本質(zhì)磨片吸收陷窩檢查，觀察A組和B組之間的多核破骨細胞的形成和骨吸收功能的差異；2實時熒光定量PCR、Western blot和免疫熒光細胞化學用來檢

3、測A組和B組破骨細胞的分化中Calmodulin和Calcineurin的mRNA水平；3使用磷酸酶活性試劑盒測定唑來膦酸對破骨細胞分化中Calcineurin活性的影響。
　　結(jié)果：1 RAW264.7細胞經(jīng)過RANKL誘導4d后，成功的分化為多核破骨細胞。2 A、B組細胞均出現(xiàn)TRAP陽性多核破骨細胞，但是在B組破骨細胞的生成受到明顯唑來膦酸的抑制。B組的破骨細胞數(shù)量為26.7±3.5，與A組（49.0±2.6）相比有顯著下降

4、（P＜0.01），減少約44.9％。B組細胞在牙本質(zhì)磨片上形成的骨吸收陷窩的數(shù)目和面積分別是6.7±1.2和997.1±14.8μm2，與A組（13.3±1.5和1676.9±24.9μm2）相比有顯著地下降，分別降低了49.6%和40.5%。3、唑來膦酸也抑制了Calmodulin和Calcineurin的基因表達。通過Real-time PCR檢測表明，B組中Calmodulin和Calcineurin兩個基因的mRNA水平與A組相

5、比分別下降約51％和37％（P＜0.05）。Western-blot也顯示，B組中的Calmodulin和Calcineurin的蛋白水平與A組相比顯著降低（P＜0.05），分別減少了78.7%和69.5%。4、Calcineurin的活性分析又進一步證實了B組細胞中Calcineurin的活性在唑來膦酸處理后的24h，48h，72h均受到了顯著抑制（P＜0.05或P＜0.01），但是A、B兩組細胞的Calcineurin活性在唑來膦酸