唑來(lái)膦酸對(duì)破骨細(xì)胞分化中鈣調(diào)蛋白、鈣調(diào)磷酸酶表達(dá)的影響.pdf

1、目的：本研究旨在探討在唑來(lái)膦酸對(duì)破骨細(xì)胞分化中參與鈣信號(hào)傳遞的兩個(gè)關(guān)鍵分子-Calmodulin和Calcineurin基因表達(dá)的影響，探討它們?cè)谶騺?lái)膦酸誘發(fā)的破骨細(xì)胞分化抑制中的作用。
　　方法：本實(shí)驗(yàn)首先建立了RAW264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞株培養(yǎng)體系，用濃度為100ng/ml的RANKL（Ligand of receptor activator of nuclear factorκB）誘導(dǎo)RAW264.7破骨細(xì)胞向分化。將細(xì)

2、胞分為A、B兩組，兩組細(xì)胞均用RANKL誘導(dǎo)4天，而B(niǎo)組的細(xì)胞在第二天加入1×10-6M唑來(lái)膦酸處理48小時(shí)，4天后收獲細(xì)胞。通過(guò)以下檢測(cè)方法，研究唑來(lái)膦酸對(duì)破骨細(xì)胞分化中 Calmodulin和Calcineurin基因表達(dá)以及破骨細(xì)胞生成的影響：1抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色和牙本質(zhì)磨片吸收陷窩檢查，觀察A組和B組之間的多核破骨細(xì)胞的形成和骨吸收功能的差異；2實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blot和免疫熒光細(xì)胞化學(xué)用來(lái)檢

3、測(cè)A組和B組破骨細(xì)胞的分化中Calmodulin和Calcineurin的mRNA水平；3使用磷酸酶活性試劑盒測(cè)定唑來(lái)膦酸對(duì)破骨細(xì)胞分化中Calcineurin活性的影響。
　　結(jié)果：1 RAW264.7細(xì)胞經(jīng)過(guò)RANKL誘導(dǎo)4d后，成功的分化為多核破骨細(xì)胞。2 A、B組細(xì)胞均出現(xiàn)TRAP陽(yáng)性多核破骨細(xì)胞，但是在B組破骨細(xì)胞的生成受到明顯唑來(lái)膦酸的抑制。B組的破骨細(xì)胞數(shù)量為26.7±3.5，與A組（49.0±2.6）相比有顯著下降

4、（P＜0.01），減少約44.9％。B組細(xì)胞在牙本質(zhì)磨片上形成的骨吸收陷窩的數(shù)目和面積分別是6.7±1.2和997.1±14.8μm2，與A組（13.3±1.5和1676.9±24.9μm2）相比有顯著地下降，分別降低了49.6%和40.5%。3、唑來(lái)膦酸也抑制了Calmodulin和Calcineurin的基因表達(dá)。通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)表明，B組中Calmodulin和Calcineurin兩個(gè)基因的mRNA水平與A組相

5、比分別下降約51％和37％（P＜0.05）。Western-blot也顯示，B組中的Calmodulin和Calcineurin的蛋白水平與A組相比顯著降低（P＜0.05），分別減少了78.7%和69.5%。4、Calcineurin的活性分析又進(jìn)一步證實(shí)了B組細(xì)胞中Calcineurin的活性在唑來(lái)膦酸處理后的24h，48h，72h均受到了顯著抑制（P＜0.05或P＜0.01），但是A、B兩組細(xì)胞的Calcineurin活性在唑來(lái)膦酸