高鹽攝入通過SGLT2調(diào)控血糖穩(wěn)態(tài)的機(jī)制.pdf

1、目的:
　　糖尿病患者的高血壓管理是降低心血管死亡率和發(fā)病率的關(guān)鍵。長期以來，高血壓的飲食調(diào)節(jié)方案重點(diǎn)關(guān)注在食鹽攝入上。因此各大指南推薦糖尿病合并高血壓患者限制鹽的攝入。然而，限鹽的潛在效益仍存有爭議，一些證據(jù)顯示，限鹽會增加糖尿病合并高血壓患者的心血管及全因死亡率，且高糖飲食對升高血壓的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于高鹽攝入。然而，關(guān)于鹽攝入與血糖穩(wěn)態(tài)之間的緊密聯(lián)系的研究仍缺乏，人們對此知之甚少。
　　人體腎臟可調(diào)節(jié)體液和電解質(zhì)的平衡，同時

2、對葡萄糖的過濾和重吸收起著至關(guān)重要的作用。其中，分布在腎臟皮質(zhì)近端小管上皮細(xì)胞管腔側(cè)的鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SGLTs)，具有調(diào)節(jié)鈉、糖重吸收的功能，能以較高效率以1∶1協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)Na+和葡萄糖。在高糖狀態(tài)下，SGLT2的活性增加，對葡萄糖和鈉的重吸收增強(qiáng)。而在糖尿病大鼠動物模型中，SGLT2突變可防止高糖誘導(dǎo)的多器官功能損害。選擇性SGLT2抑制劑可改善糖尿病患者的高血糖，并有呈現(xiàn)出輕微的降壓作用。
　　近10年來，過氧化物酶體

3、增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activatedreceptor，PPAR)已經(jīng)成為心血管代謝疾病的新型有效治療靶點(diǎn)。人類腎臟表達(dá)不同的三種PPAR亞型，PPARα，PPARγ和PPARδ，在機(jī)體的糖脂代謝中發(fā)揮了重要作用。現(xiàn)今糖尿病治療用噻唑烷二酮類(TZD)藥物，就是通過激活脂肪組織PPARγ改善胰島素抵抗，從而發(fā)揮改善血糖的作用。然而，研究表明TZD類藥物可能導(dǎo)致水鈉潴留及心衰，大大限制了其臨床應(yīng)

4、用。PPARδ在幾乎所有的細(xì)胞與組織中均存在表達(dá)，被認(rèn)為參與了許多慢性病的發(fā)病過程，包括高血壓、糖尿病、粥樣硬化以及肥胖等，其特異性激動劑或基因表達(dá)上調(diào)均可有效緩解肥胖伴糖尿病嚙齒類動物的高血脂、血糖和胰島素抵抗。在糖尿病大鼠中，特異性激動PPARδ表達(dá)后表現(xiàn)出腎臟保護(hù)作用。此外，PPARδ激動劑增加的脂肪脂聯(lián)素的表達(dá)，可在心血管疾病中發(fā)揮有益作用。然而，目前尚不清楚PPARδ是否通過調(diào)節(jié)脂聯(lián)素表達(dá)參與了腎臟對鈉的處置以及對葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)

5、。
　　脂聯(lián)素是脂肪組織尤其是內(nèi)臟脂肪組織分泌最豐富的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。脂聯(lián)素通過其特異性受體，AdipoR1和AdipoR2，在多種組織和細(xì)胞中發(fā)揮其生理功能。已有研究發(fā)現(xiàn)PPARs在脂聯(lián)素的表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮了重要作用。應(yīng)用PPARδ激動劑可顯著升高內(nèi)臟脂肪脂聯(lián)素的表達(dá)水平，從而發(fā)揮改善心血管代謝紊亂的綜合效應(yīng)。血清脂聯(lián)素水平在多種代謝性心血管疾病中降低，同時低脂聯(lián)素水平可能是胰島素抵抗發(fā)生、發(fā)展的重要原因。攝鹽量對脂聯(lián)素分泌有重要作用

6、，低鹽干預(yù)可顯著上調(diào)脂肪組織脂聯(lián)素分泌，同時改善胰島素抵抗以及全身炎癥反應(yīng)。但脂聯(lián)素如何參與鹽的代謝尚不明確。
　　在本研究中，我們提出PPARδ通過調(diào)節(jié)脂聯(lián)素表達(dá)參與了腎小管SGLT2對鈉的轉(zhuǎn)運(yùn)和葡萄糖的重吸收過程，干預(yù)該環(huán)節(jié)中的一個或多個關(guān)鍵靶點(diǎn)可維持或恢復(fù)鈉和葡萄糖穩(wěn)態(tài)的科學(xué)假設(shè)，并開展了一系列的細(xì)胞、動物實(shí)驗(yàn)及臨床驗(yàn)證，為了驗(yàn)證上述假設(shè)，本研究分為兩部分進(jìn)行:1、驗(yàn)證高鹽攝入影響血糖穩(wěn)態(tài)及鹽排泄，側(cè)重觀察PPARδ介導(dǎo)的脂

7、聯(lián)素分泌對SGLT2產(chǎn)生作用及其對尿鈉及尿糖排泄的影響及其機(jī)制。2、在糖尿病動物模型中觀察高鹽攝入對SGLT2作用的影響及其機(jī)制，并在臨床糖尿病患者中驗(yàn)證，結(jié)果表明脂肪PPARδ在脂聯(lián)素介導(dǎo)的腎臟SGLT2調(diào)節(jié)鈉糖平衡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
　　材料與方法:
　　本研究包括兩部分:1.驗(yàn)證高鹽對尿鈉排泄和葡萄糖穩(wěn)態(tài)的影響，研究高鹽致脂肪PPARδ激活后由脂聯(lián)素介導(dǎo)的促進(jìn)小鼠腎臟尿鈉和葡萄糖排泄的分子機(jī)制，同時在小鼠模型中測試SGL

8、T2的急性功能改變。2.在第一部分實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，在db/db糖尿病動物模型中研究高鹽攝入對SGLT2表達(dá)及功能的影響，并在臨床糖尿病患者中分析血糖、脂聯(lián)素、尿鈉三者的關(guān)系。
　　1.3T3-L1前脂肪細(xì)胞以及C57BL/6小鼠原代脂肪細(xì)胞的分組培養(yǎng)，免疫印跡檢測PPAR各亞型的表達(dá)，并設(shè)立氯化鈉和甘露醇梯度的滲透壓濃度，作為對照觀察PPARδ的表達(dá)變化。
　　2.脂肪特異敲除PPARδ小鼠（Fabp4-PPARδflox/fl

9、ox）模型構(gòu)建，在高鹽（8％氯化鈉）和普食（0.4％氯化鈉）喂養(yǎng)條件下，觀察小鼠尿鈉排泄的變化、脂聯(lián)素的分泌及達(dá)格列凈（特異性SGLT2抑制劑）干預(yù)后腎臟SGLT2表達(dá)的變化。
　　3.Adn-/-小鼠注射外源性脂聯(lián)素Acrp30，觀察其遷移表達(dá)特性。
　　4.Adn+/+和Adn-/-小鼠分組培養(yǎng)后，予以PPARδ激動劑，免疫印跡法檢測腎周脂肪及腎臟皮質(zhì)SGLT2、脂聯(lián)素的表達(dá)，觀察小鼠尿鈉、尿糖排泄及糖耐量變化。

10、　　5.高鹽及普食喂養(yǎng)db/db糖尿病小鼠后，觀察小鼠尿鈉、尿糖排泄等改變，予以達(dá)格列凈干預(yù)，檢測小鼠腎臟SGLT2的表達(dá)，并觀察小鼠24小時尿鈉、尿糖排泄及血糖變化。
　　6.收集糖尿病患者血漿樣本，檢測患者空腹血糖、糖化血紅蛋白、血清脂聯(lián)素、24小時尿鈉，分析各指標(biāo)之間的相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　1.高鹽（8％鹽濃度）培養(yǎng)下3T3-L1前脂肪細(xì)胞和C57BL/6小鼠原代脂肪細(xì)胞中PPARδ表達(dá)顯著升高，氯化鈉和甘露

11、醇（滲透壓對照）以濃度依賴的方式顯著增加PPARδ的表達(dá)。
　　2.與Fabp4-PPARδflox/flox小鼠相比，8％高鹽攝入明顯降低PPARδflox/flox小鼠的空腹血糖水平。高鹽攝入顯著增加Fabp4-PPARδflox/flox小鼠和PPARδflox/flox小鼠尿量和尿鈉排泄以及血漿和腎周脂肪的鈉含量，同時降低血漿醛固酮水平。高鹽攝入顯著降低PPARδflox/flox小鼠腎臟皮質(zhì)SGLT2表達(dá)。達(dá)格列凈顯著增

12、加高鹽喂養(yǎng)下PPARδflox/flox小鼠尿鈉及尿糖排泄。
　　3.高鹽攝入的PPARδflox/flox小鼠腎周脂肪和腎皮質(zhì)中脂聯(lián)素表達(dá)顯著增加，血漿脂聯(lián)素水平在PPARδflox/flox小鼠升高而在Fabp4-PPARδflox/flox小鼠中降低。予以PPARδ激動劑GW501516處理PPARδflox/flox小鼠原代培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞致脂聯(lián)素表達(dá)升高，而PPARδ拮抗劑GSK0660則降低其表達(dá)。
　　4.染色質(zhì)

13、免疫共沉淀的結(jié)果表明，臘聯(lián)素(Acrp30)干預(yù)后，SLCSA2基因啟動子部位HNF-1a和sp-1的結(jié)合水平顯著降低。
　　5.GW501516顯著提高Adn+/+小鼠血漿脂聯(lián)素水平和腎周脂肪、腎皮質(zhì)脂聯(lián)素的表達(dá)，但對Adn-/-小鼠無此效應(yīng)，口服葡萄糖灌胃后，GW501516促進(jìn)尿鈉和尿糖排泄的作用在Adn-/-小鼠中削弱了。GW501516干預(yù)后腎臟SGLT2的表達(dá)明顯增強(qiáng)，而高鹽對腎臟SGLT2表達(dá)的抑制作用在Adn-/-

14、小鼠中消除了。
　　6.高鹽飲食不僅增加db/db小鼠的尿鈉排泄，也增加尿量和尿糖。db/db小鼠腎臟SGLT2表達(dá)顯著高于db/m小鼠，而高鹽攝入可下調(diào)其表達(dá)。達(dá)格列凈干預(yù)后，高鹽喂養(yǎng)的db/db小鼠尿鈉排泄和尿糖的升高幅度低于db/m小鼠。
　　7.在糖尿病患者中，尿鈉排泄與空腹血糖、糖化血紅蛋白存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。此外，血糖或糖化血紅蛋白控制良好的糖尿病患者的尿鈉排泄更高，尿鈉排泄量和血漿脂聯(lián)素水平之間有明顯的相關(guān)性